豬胃腸炎病毒的分離鑒定及S基因的克隆、序列分析與原核表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissi-ble Gastroenteritis virus，TGEV)引起的一種以仔豬嘔吐、水樣腹瀉和高死亡率為主要特征的傳染病。各種年齡的豬都可感染，且感染豬生長(zhǎng)緩慢，飼料報(bào)酬率低，2005年以來，河南TGE的流行呈明顯上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的TGEV基因序

2、列(NC002306)，針對(duì)TGEV S基因設(shè)計(jì)合成了_二對(duì)引物，以TGEV疫苗株(YM)為模板，建立了TGEV的RT-PCR檢測(cè)方法。利用建立的方法檢測(cè)TGEV、PRRSV、HCLV、PCV2、PRV，只有TGEV擴(kuò)增出預(yù)期497bp的條帶，而其他未出現(xiàn)任何條帶，說明了所建檢測(cè)方法的高度特異性，并且可檢測(cè)10-5倍稀釋的cDNA模板。運(yùn)用所建方法對(duì)新鄉(xiāng)原陽(XXYY)、開封(KF)、新鄭(XZ)、駐馬店(ZMD)、新鄉(xiāng)獲嘉(XXHJ)

3、、南陽(NY)6個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)疑似TGEV病料組織中的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均可得到與預(yù)期大小497bp相符的特異性片段，同時(shí)用BanⅡ?qū)δz回收后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，產(chǎn)物可被酶切成與預(yù)期大小相符的373bp和124bp兩條片段。運(yùn)用市售TGEV抗原檢測(cè)試紙卡進(jìn)行復(fù)檢，與RT-PCT檢測(cè)結(jié)果完全一致。 參照GenBank發(fā)表的TGEV基因序列(登錄號(hào)NC002306)，利用自行設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，以TGEVXZ、NY、

4、YM、XXYY、KF株的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物為材料，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出S基因，運(yùn)用PGM-T和PMD18-T兩種載體，通過TA克隆，獲得重組質(zhì)粒PGM-XZ-S、PGM-NY-S、PGM-YM-S、PMD-XX-S和PMD-KF-S。經(jīng)序列分析得知，河南分離株之間的同源性很高，核苷酸同源性為99.0％-99.8％，氨基酸同源性為97.0％.99.0％；河南株和疫苗株的核苷酸同源性為99.0％.99.7％，氨基酸同源性為97.0％

5、-98.5％；XZ株與國外的Purdue株核苷酸同源性最高達(dá)99.7％，氨基酸同源性最高達(dá)99.0％；XZ株與SC-Y株氨基酸同源性最高達(dá)100％，但XX、KF、NY株與SC-Y株核苷酸同源性分別依次為99.0％、98.5％、99.5％。說明S基因是高度保守的，也說明不同地方的分離株存在一定的差異。分析還得知由河南分離株擴(kuò)增的片段均存在抗原位點(diǎn)，這為以后的研究奠定了基礎(chǔ)。 以自行構(gòu)建的PGM-XZ-S為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雙酶切

6、后克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-XZ-S，將重組原核表達(dá)載體pET-XZ-S轉(zhuǎn)化到E-coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測(cè)，目標(biāo)蛋白獲得了大量表達(dá)，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件，確認(rèn)最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.6mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3h，融合蛋白大小為42KD。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，融合蛋白具有免疫原性，為研究TGEV亞單位疫苗、制備診斷抗原和建立EL