豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白A、D基因與豬大腸肝菌LTB基因的重組、克隆及原核表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的一種以嘔吐、脫水、嚴(yán)重腹瀉為主要特征的急性、高度接觸性傳染病。產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是引起仔豬腹瀉的一種重要的腸道病原菌,能夠引起仔

2、豬黃痢和仔豬白痢等。根據(jù)GenBank中公布的TGEV的S蛋白A、D基因序列和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)基因序列,分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增含A、D位點(diǎn)的S1基因和LTB基因,各自將其插入pET-28a(+)載體中構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,并進(jìn)行PCR、酶切鑒定及序列測(cè)定。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western-blot進(jìn)行檢測(cè)。
　　 RT-PCR擴(kuò)增得到了S1基因片段,該基因全長(zhǎng)9

3、80bp,編碼262個(gè)氨基酸,序列分析顯示S1基因與GenBank中公布的S1基因序列同源性達(dá)97％以上,氨基酸序列同源性達(dá)95％以上,表明不同毒株S1基因高度保守性。表達(dá)獲得的S1蛋白約33.7ku,并且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在；Western-blot分析表明,表達(dá)的S1蛋白可以被TGEV陽(yáng)性血清所識(shí)別,具有反應(yīng)原性。同樣,PCR擴(kuò)增得到的LTB基因全長(zhǎng)375bp,編碼124個(gè)氨基酸,序列分析顯示LTB基因與GenBank中公

4、布的LTB基因序列同源性達(dá)99％以上,氨基酸序列同源性達(dá)98％以上。表達(dá)獲得的LTB蛋白約14ku。Western-blot分析表明,LTB蛋白能被ETEC陽(yáng)性血清所識(shí)別,具有反應(yīng)原性。
　　 重新設(shè)計(jì)1個(gè)引物,使LTB基因的終止密碼子TAG突變?yōu)門AC,且在其下游添加EcoRI酶切位點(diǎn)。另設(shè)計(jì)1個(gè)引物,在S1基因上游引入EcoRI酶切位點(diǎn),并以上述試驗(yàn)擴(kuò)增的S1基因和LTB基因?yàn)槟０?再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切和連接等