枯草芽孢桿菌pgsA與豬傳染性胃腸炎病毒Sa融合基因的原核表達(dá).pdf

1、1.根據(jù)GenBank中已發(fā)表的枯草芽孢桿菌pgsA基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)能擴(kuò)增1155bp基因片段的引物，引物兩端分別有KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。以枯草芽孢桿菌染色體DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-pgsA。用DNAstar軟件將其與GenBank上的pgsA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明核苷酸同源

2、性在90％以上，氨基酸同源性94％以上。核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)株與浙江株親緣關(guān)系最近。經(jīng)ProtScale軟件分析表明:該基因所編碼蛋白在靠近其N端存在一個(gè)跨膜區(qū)，為跨膜表達(dá)體系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 2.將豬傳染性胃腸炎病毒接種ST細(xì)胞進(jìn)行增殖，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變后，將細(xì)胞反復(fù)凍融三次收獲病毒。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S基因的序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)擴(kuò)增S基

3、因包含A抗原位點(diǎn)724bp基因片段(Sa)的引物，引物兩端分別有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。以感染細(xì)胞提取的病毒RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-Sa。用DNAstar軟件將其與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明核苷酸同源性為97％以上，氨基酸同源性為93％以上。根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒

4、Sa基因核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，試驗(yàn)株與TH-98株親緣性最近。
　　 3.對(duì)克隆載體pMD18-T-pgsA做KpnⅠ和BamHⅠ的雙酶切，將所得片段插入表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-pgsA，對(duì)克隆載體pMD18-T-Sa和重組質(zhì)粒pET-pgsA分別做BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將Sa片段插入到pET-pgsA中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pgsA-Sa。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，