家蠶BmmY基因的克隆、表達(dá)與功能的初步研究.pdf

1、E(spl)my基因是果蠅中的剪切增強(qiáng)子，為Notch信號通路的下游調(diào)控靶基因，與果蠅的神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，目前該方面的研究主要在果蠅中進(jìn)行，家蠶、小鼠等哺乳動物中也有發(fā)現(xiàn)Notch途徑的保守靶基因序列，有關(guān)其編碼的蛋白功能研究報道甚少。
　　 家蠶Bmmy(Bombyxmori，E(spl)my)是果蠅E(spl)my的同源基因，GenBank登錄號為AB474582，該基因ORF框為747bp，編碼249個氨基酸殘基，預(yù)測分子

2、量為27.91kDa。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在體虱、大紅斑蝶、火蟻、谷蛀蟲和切葉蜂中的都有高度保守的同源序列。RT-PCR方法從化蛹第三天的蛹組織中克隆得到完整ORF片段，并克隆到T載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，挑選克隆培養(yǎng)后提質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，連接到表達(dá)載體pET-28a上，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體pET-28a-Bmmy，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)提質(zhì)粒、雙酶切鑒定正確后，測序分析。陽

3、性克隆培養(yǎng)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌體總蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在約35kDa的位置有一條特異性目的條帶與預(yù)期值（Bmmy27.91kDa,加融合標(biāo)簽3.56kDa）相符，重組蛋白以包涵體的形式存在，Westernblot鑒定正確。用8M尿素溶解該蛋白，采用用Ni親和層析的方法純化，純化蛋白以1mg/次的劑量皮下注射新西蘭大白兔，免疫后采血制備多克隆抗體，ELISA檢測其效價為1∶12800。用該抗體檢測Bmmy蛋白在家蠶蛹、五

4、齡幼蟲的組織分布及家蠶BmN亞細(xì)胞定位。通過Westemblot、實時熒光定量PCR和免疫組化發(fā)現(xiàn)Bmmy在家蠶不同發(fā)育時期的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平有較大差異，蛹和卵的表達(dá)量較高，而在四齡幼蟲和蛾中表達(dá)較少;在家蠶五齡幼蟲各組織中頭、皮、性腺、氣門、脂肪體、絲腺中均較高表達(dá)，而在馬氏管、血淋巴液和腸較少。但是各個時期熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在五齡幼蟲、蛾、一齡幼蟲中的mRNA水平含量較高;各個組織熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因

5、在腸、皮、馬氏管部位的mRNA水平含量較高，與Westemblot蛋白檢測結(jié)果表達(dá)不完全一致，該蛋白表達(dá)可能存在翻譯水平的調(diào)控;蛾四個部位免疫印跡顯示該蛋白在胸部表達(dá)量最高。免疫組化結(jié)果顯示該蛋白主要分布在五齡幼蟲頭部、絲腺、皮、性腺以及蛹的頭部、腸道及體壁。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。分別采用不同時間和梯度濃度的Notch信號途徑阻斷劑DAPT處理家蠶BmN細(xì)胞，之后提取細(xì)胞的總RNA，用熒光定量PCR檢測Bmmy基