家蠶BnMP54基因與多角體基因的融合表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、浙江理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對(duì)所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：jR期：汐?！骸耗辍墼隆稳諟y(cè)其含有2個(gè)跨膜區(qū)域，將其命名為BmMP54。將BmMP54基因與多角體基

2、因仞olyhedrinPolh)融合并分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T1和家蠶桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacHTB中構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別在大腸桿菌BL21(DE3)和家蠶細(xì)胞中表達(dá)該融合蛋白。根據(jù)eDNA序列的ORF框設(shè)計(jì)上下游引物，PCR擴(kuò)增Polh與BmMP54基因片段后分別經(jīng)BamHI／EcoRI與EcoRI／XhoI雙酶切，插入融合表達(dá)載體pGEX4T1的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，成功構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3

3、)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組J下確。用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌后，裂解菌體作SDSPAGE分析，在65kD左右的位置有一濃集特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符。原核表達(dá)的融合蛋白以包涵體的形式存在，利用多角體蛋白的特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)pH值的方法進(jìn)行初步純化，再經(jīng)陰離子交換層析進(jìn)一步純化。利用BactoBac系統(tǒng)構(gòu)建含尸D偽BmMP54基因的重組病毒vBmPolhBmMP54，并感染家蠶BmN細(xì)胞，Westernb

4、lotting分析表明Polh一砌M乃4基因在家蠶細(xì)胞中成功得到表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)BmMP54在五齡幼蟲的不同組織中表達(dá)量差異較大，其中氣門和脂肪體組織中表達(dá)量最高，表皮和頭部中最低。另外，在RNAi實(shí)驗(yàn)中，MTT檢測(cè)表明BmMP54基因被沉默則增加細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明細(xì)胞會(huì)加速BmN細(xì)胞進(jìn)入S期及G2期。BmMP54基因的沉默有助于細(xì)胞快速通過G1期的檢驗(yàn)點(diǎn)，這說明BmMP54基因可能與阻礙細(xì)胞通過檢驗(yàn)點(diǎn)有關(guān)