家蠶BnMP54基因與多角體基因的融合表達及其功能的初步研究.pdf

1、浙江理工大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學術(shù)道德，崇尚嚴謹學風。所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負責，并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學位論文作者簽名：jR期：汐?！骸耗辍墼隆稳諟y其含有2個跨膜區(qū)域，將其命名為BmMP54。將BmMP54基因與多角體基

2、因仞olyhedrinPolh)融合并分別克隆到原核表達載體pGEX4T1和家蠶桿狀病毒表達載體pFastBacHTB中構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別在大腸桿菌BL21(DE3)和家蠶細胞中表達該融合蛋白。根據(jù)eDNA序列的ORF框設(shè)計上下游引物，PCR擴增Polh與BmMP54基因片段后分別經(jīng)BamHI／EcoRI與EcoRI／XhoI雙酶切，插入融合表達載體pGEX4T1的相應酶切位點，成功構(gòu)建重組融合蛋白表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3

3、)感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組J下確。用終濃度為1mM的IPTG誘導重組菌后，裂解菌體作SDSPAGE分析，在65kD左右的位置有一濃集特異性蛋白條帶，與預期值相符。原核表達的融合蛋白以包涵體的形式存在，利用多角體蛋白的特點，通過調(diào)節(jié)pH值的方法進行初步純化，再經(jīng)陰離子交換層析進一步純化。利用BactoBac系統(tǒng)構(gòu)建含尸D偽BmMP54基因的重組病毒vBmPolhBmMP54，并感染家蠶BmN細胞，Westernb

4、lotting分析表明Polh一砌M乃4基因在家蠶細胞中成功得到表達。利用實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)BmMP54在五齡幼蟲的不同組織中表達量差異較大，其中氣門和脂肪體組織中表達量最高，表皮和頭部中最低。另外，在RNAi實驗中，MTT檢測表明BmMP54基因被沉默則增加細胞凋亡，流式細胞儀檢測表明細胞會加速BmN細胞進入S期及G2期。BmMP54基因的沉默有助于細胞快速通過G1期的檢驗點，這說明BmMP54基因可能與阻礙細胞通過檢驗點有關(guān)