家蠶Bm040825基因的表達(dá)及其功能初步研究.pdf

1、從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選得到一條新的cDNA，經(jīng)NCBI比對分析后初步確定其為一未知基因，命名為家蠶Bm040825(Bombyxmori040825)，GenBank登陸號為DN236938。家蠶Bm040825基因cDNA長為869bp，開放閱讀框大小為489bp，采用DNrAStar軟件進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因編碼162個氨基酸殘基，預(yù)測分子量大小為19.4kD，等電點為9.58。從GenBank等數(shù)據(jù)庫中利用Blast

2、檢索，發(fā)現(xiàn)與Bombyxmori同源性較高的均為一些假設(shè)或預(yù)測蛋白，這些蛋白功能未知。將家蠶Bm040825的cDNA序列與家蠶基因組序列比對，結(jié)果表明該基因由一個外顯子組成。 我們根據(jù)cDNA序列的ORF框設(shè)計上下游引物，PCR擴增后經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，插入融合表達(dá)載體pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點，成功構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確

3、。IPTG誘導(dǎo)后裂解菌作SDS-PAGE分析，在23kD處有一濃集特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達(dá)，通過親和層析純化了重組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，ELISA檢測效價大于1:6400。以家蠶Bm5細(xì)胞進行免疫細(xì)胞化學(xué)實驗，結(jié)果顯示，在未分裂細(xì)胞中，Bm040825蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中均有分布，而對于處在分裂期的細(xì)胞，Bm040825蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核內(nèi)幾乎不存在。構(gòu)建綠