Bm Antp基因?qū)倚Q翅發(fā)育調(diào)控的安步研究.pdf

1、翅作為動物發(fā)育過程中進化出的新器官，對于動物從水生到陸生，從低空到高空的跨越具有非常重要的意義。昆蟲是最先擁有翅的無脊椎動物，翅的獲得是昆蟲迅速成為地球上種類最多分布最廣的生物類群的主要原因。
　　家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的重要模式。研究家蠶翅突變的形成機制，不僅可以豐富昆蟲翅發(fā)育調(diào)控理論，也可為鱗翅目害蟲防控提供新的理論支撐。已有研究表明，昆蟲翅的發(fā)生與Hox基因的表達密切相關(guān)。翅被限定于第2和第3胸節(jié)，這是因為Ho

2、x基因的精確表達誘導(dǎo)翅在特定的位置發(fā)生，同時抑制了翅在其它環(huán)節(jié)的生長。如Scr抑制了第1胸節(jié)翅原基細胞的發(fā)育，Ubx和abd-A抑制了腹部區(qū)域翅的發(fā)育。Ubx基因只在后翅表達，它的作用在于調(diào)節(jié)不同的下游靶基因，從而導(dǎo)致前后翅形態(tài)特征的差異。Hox基因Antp在胸部表達，而在果蠅和赤擬谷盜中干涉Antp基因?qū)Τ岬男螒B(tài)并沒有影響，表明該基因并不是果蠅和赤擬谷盜翅發(fā)育所必需的。在西南大學(xué)家蠶庫保存的翅突變體中，Nc、Wes和EM都表現(xiàn)為純合體

3、胚胎致死，胸足發(fā)育異常，雜合體表現(xiàn)為成蟲翅變小且為畸形。此前研究已表明Nc、Wes均是由于BmAntp基因突變所致，這表明BmAntp基因的異常表達能調(diào)控家蠶翅的發(fā)育，影響翅的形態(tài)。我們從這3個材料出發(fā)，研究BmAntp基因在家蠶翅發(fā)育中的表達模式特征，初步鑒定BmAntp基因在翅發(fā)育中的功能。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.突變雜合體與野生型翅的表型差異
　　我們解剖突變雜合體和野生型不同發(fā)育時期的翅原基、蛹翅和蛾翅，對

4、它們的表型特征進行觀察比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體與野生型在上蔟前翅原基大小形態(tài)無明顯差異，而上蔟后第2天隨著翅原基展開，可觀察到突變體翅原基無法正常伸展，出現(xiàn)皺縮、折疊、卷曲現(xiàn)象，化蛹后蛹翅殘缺短小覆蓋不全，成蟲表現(xiàn)為畸形小翅。
　　2.BmAntp在家蠶翅發(fā)育中的表達模式
　　為了更好地了解BmAntp基因在家蠶翅發(fā)育中的功能，我們調(diào)查了BmAntp基因在家蠶前后翅中的表達模式。以野生型大造五齡1天至化蛾前后翅原基cDNA為材

5、料，通過定量PCR檢測BmAntp基因在家蠶前后翅的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmAntp在大造前后翅均有表達且變化趨勢基本一致，在上蔟前表達量維持在一個較低水平，而化蛹后該基因表達明顯上升，一直持續(xù)到羽化前一天達到最高峰，之后表達下降。由此可以看出BmAntp在家蠶前后翅都有持續(xù)一致的表達，表達水平與翅的變態(tài)發(fā)育具有對應(yīng)性，暗示對翅的發(fā)育有重要調(diào)控作用。
　　3.突變體和野生型中BmAntp基因的結(jié)構(gòu)和表達分析
　　通過對EM突

6、變純合體和野生型大造胚胎cDNA進行Antp序列分析，發(fā)現(xiàn)EM突變純合體中BmAntp基因Type1轉(zhuǎn)錄本3'UTR區(qū)存在異常。進一步對基因3UTR區(qū)進行RACE分析，發(fā)現(xiàn)在大造胚胎中擴增得到了兩種新的轉(zhuǎn)錄本Type2、Type3，突變體中只擴增出一種Type3。從五齡至羽化選取幾個關(guān)鍵時期對Wes、Nc和EM雜合體和野生型翅原基中BmAntp的表達水平進行定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)雜合體中BmAntp基因表達升高。為了進一步鑒定轉(zhuǎn)錄水平高表

7、達是由BmAntp的正常還是異常轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致，我們通過Westemblot進行蛋白水平上的表達分析，結(jié)果顯示，在突變雜合體中Antp蛋白表達降低。說明Wes、Nc和EM雜合體中翅的突變表型可能是由于BmAntp蛋白的功能缺失引起的。
　　4.BmAntp基因?qū)倚Q翅發(fā)育調(diào)控的機制初探
　　我們選取了三個突變中翅突變表型最為明顯的Wes突變體和野生型，在上蔟48h對翅發(fā)育通路中關(guān)鍵基因如ap、vg、en等進行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)在

8、雜合體中這些基因表達量均降低。為了探究BmAntp對這些基因的調(diào)控關(guān)系，我們對這些基因上游進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測分析，選取結(jié)合預(yù)測值較高的上游關(guān)鍵基因ap和vg，通過EMSA探究Antp蛋白與這兩個基因的作用關(guān)系。結(jié)果顯示，BmAntp作為轉(zhuǎn)錄因子，可與ap和vg直接結(jié)合，改變基因的表達，從而影響翅的發(fā)育。同時我們選取蛹5天Wes雜合體和野生型大造的前后翅分別進行芯片分析，結(jié)果顯示，在Wes雜合體前翅中共篩查到24個上調(diào)表達的基因和14個