BmDaxx基因對家蠶細胞及幼蟲組織凋亡的調(diào)控作用.pdf

1、Daxx（死亡結構域相關蛋白）是一種具有多種生物功能的核蛋白。Daxx最初被鑒定為具有調(diào)控凋亡信號途徑的功能分子和與Fas的死亡結構域(death domain of Fas，F(xiàn)asDD)發(fā)生相互作用的蛋白。其可定位于核仁、核質、胞質、早幼粒細胞和異染色質中。Daxx特異地與Fas死亡結構域結合，過表達Daxx增強了Fas介導的凋亡，并且激活了JNK通路。Daxx的C端與Fas死亡結構域相互作用，而另外一個結構域則激活JNK通路。Dax

2、x不僅在細胞凋亡途徑中起著非常重要的作用，同時也參與許多疾病的調(diào)節(jié)，如在腫瘤和白血病的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。然而Daxx在昆蟲和哺乳動物的作用有一些不同。BmDaxx在家蠶中調(diào)節(jié)死亡受體介導的凋亡通路的分子機制仍然不清楚，BmDaxx與上下游基因的相互作用也仍然沒有報道。
　　本研究主要包括以下6個部分的內(nèi)容:
　　(1)克隆并鑒定了家蠶BmDaxx基因，并且對其進行生物信息學分析，預測蛋白大小為67.74KDa。

3、　　(2)在BmN細胞系中進行BmDaxx基因的過表達和siRNA干擾實驗，并檢測caspase-3激活數(shù)，同時利用短波紫外線(UVC)和放線菌素D誘導細胞凋亡。在這不同的誘導情況下，通過流式細胞術分析細胞凋亡率。實驗數(shù)據(jù)表明，當BmDaxx基因表達量增高時，能夠引起caspase-3酶活性的增高，流式細胞術檢測的凋亡率也相應升高。而當BmDaxx基因的表達由三條不同靶點的siRNA干擾后，caspase-3的激活數(shù)有所下降，紫外線誘導

4、的細胞凋亡率沒有明顯區(qū)別，然而放線菌素D誘導的細胞凋亡率沒有降低反而有一些升高，但沒有達到顯著性差異。
　　(3)通過在BmN細胞中過表達和干擾BmDaxx基因，同時檢測另外的凋亡相關基因BmFadd和BmDredd的表達量，結果發(fā)現(xiàn)BmFadd和BmDredd的表達量變化趨勢與BmDaxx的表達量變化趨勢一致。用caspase-3抑制劑處理細胞后發(fā)現(xiàn)這三個基因的轉錄水平都有明顯下降，因此推測BmDaxx、BmFadd和BmDre

5、dd在同一條凋亡通路間存在相互關系，并且為正相關。
　　(4)實時熒光定量PCR檢測BmDaxx基因在家蠶不同生長時期、不同組織中的轉錄表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，該基因在家蠶吐絲時的絲腺中表達量開始顯著升高，在吐絲36小時時的絲腺中表達量達到高峰，特別是在后部絲腺中的表達量達到最高。這與家蠶絲腺的發(fā)育變化情況一致。這表明BmDaxx參與了家蠶變態(tài)發(fā)育過程中絲腺的退化。
　　(5)用caspase抑制劑處理家蠶BmN細胞，并在吐絲時

6、對家蠶進行體內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)在caspase抑制劑處理的BmN細胞中caspase-3酶活性有顯著的降低，流式細胞術檢測細胞凋亡率也有明顯下降，BmDaxx，BmFadd和BmDredd三個基因的表達量也有明顯降低。在注射caspase抑制劑的家蠶中，BmDaxx、BmFadd和BmDredd的轉錄水平也有明顯降低。因此推測這三個基因在細胞和個體水平上都相互作用并同時參與凋亡通路。
　　(6)在BmN細胞和家蠶絲腺中定位了BmDaxx

7、蛋白。用放線菌素D處理BmN細胞誘導凋亡，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡時BmDaxx蛋白在細胞中位置的變化。用石蠟切片的方法觀察BmDaxx蛋白在五齡第3天時與表達量最高的吐絲36小時的絲腺中的變化。發(fā)現(xiàn)當用放線菌素D誘導細胞凋亡時，BmDaxx蛋白發(fā)生遷移，更多的從細胞核轉移到細胞質中。而家蠶絲腺中在吐絲36小時的絲腺凋亡最為激烈的時期相對于五齡3天時BmDaxx蛋白的表達量更多，這也與之前熒光定量測得的BmDaxx基因的表達量相一致