家蠶凋亡相關(guān)基因ice的克隆表達(dá)及對病毒感染家蠶細(xì)胞的影響.pdf

1、ICE(白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶)是Caspase家族(半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶cys-teinylaspartate specific proteinase)中最早發(fā)現(xiàn)的成員，在多細(xì)胞生物的程序性細(xì)胞死亡中起著重要的作用。到目前為止，已有11種人的，10種鼠的，4種鳥和魚的，8種兩棲類的，7種昆蟲和3種線蟲的Caspase得到了解析。但是在基因庫中公布的家蠶ice類似基因序列(GenBank登錄號為：AY885228)僅為一條，其功能未

2、知。本研究根據(jù)這個ice基因設(shè)計(jì)特異引物，從家蠶細(xì)胞中獲得了不同于ice的兩個新基因，分別命名為ice-2和ice-5(GenBank登錄號分別為：DQ360829，DQ360830)。它們的讀碼框分別為852和936 bp，編碼284和312個氨基酸。對ice，ice-2和ice-5序列分析得知這3個基因之間既有相同之處也存在著差異。ice和ice-2都含有7個外顯子，而ice-5含8個外顯子，它們的前5個外顯子和最后1個外顯子相同。

3、ice和ice-2的差別之處在第6個外顯子的中間處，ice-2比ice多出30個堿基。 ICE家族的蛋白成熟過程中會發(fā)生自我酶解，為了了解ICE-2和ICE-5的酶解方式，本研究利用了能穩(wěn)定表達(dá)蛋白的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分別采用高溫37℃和室溫25℃的條件誘導(dǎo)表達(dá)了ICE-2和ICE-5。在37℃誘導(dǎo)前期ICE-2和ICE-5不發(fā)生酶解，分別在33 kD和36 kD處有明顯條帶；在誘導(dǎo)3 h后，ICE-2除了33 kD處有特異條

4、帶外，23 kD處也出現(xiàn)了特異帶，而ICE-5無變化。推測過量ICE-2發(fā)生部分自我酶解現(xiàn)象。在25℃條件誘導(dǎo)下，ICE-5只在26 kD處有特異條帶，而ICE-2檢測不到條帶，推測ICE-2和ICE-5的酶解方式不一樣。 為了研究獲得的ice-2和ice-5在凋亡通路中的作用，采用紫外線刺激家蠶幼蟲和細(xì)胞、過氧化氫和病毒刺激家蠶細(xì)胞，利用熒光定量PCR的方法檢測不同因素刺激下ice-2和ice-5的表達(dá)量變化。檢測結(jié)果得知：

5、在低劑量的紫外線刺激的家蠶幼蟲和細(xì)胞中，ice-2的表達(dá)量在某個刺激時間點(diǎn)上有高表達(dá)，而ice-5的表達(dá)量無明顯變化，說明ice-2可能與修復(fù)機(jī)制有關(guān)。在高劑量的紫外線刺激的家蠶幼蟲和細(xì)胞中，ice-5的表達(dá)量變化比ice-2的明顯。在過氧化氫刺激及病毒感染的家蠶細(xì)胞中ice-2和ice-5的表達(dá)量隨著刺激劑量的增加都發(fā)生變化，ice-5的表達(dá)量變化的更明顯。說明ice-2和ice-5都參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行，ice-5比ice-2起更重要

6、的作用。 通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究了過量表達(dá)ice-2和ice-5對病毒感染家蠶細(xì)胞的影響。將ice-2和ice-5基因分別克隆到表達(dá)載體HTB，然后轉(zhuǎn)化BmDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素及藍(lán)白斑篩選得到重組桿粒Bacmid-ICE-2和Bacmid-ICE-2，通過pUC/M13引物的PCR結(jié)果顯示這兩個重組桿粒為陽性克隆。將該桿粒轉(zhuǎn)染家蠶Bm細(xì)胞，得到病毒粒子r-ice-2和r-ice-5。以ice-2及ice-5基因

7、的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)一步對病毒粒子DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果證明病毒含ice-2及ice-5基因。將病毒粒子感染Bm細(xì)胞，采用形態(tài)觀察、細(xì)胞存活率計(jì)數(shù)、DNA Ladder檢測DNA片段化等方法測定細(xì)胞的變化。試驗(yàn)表明，ice-2和ice-5都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ice-5比ice-2的誘導(dǎo)凋亡作用更明顯。 本研究從家蠶細(xì)胞中獲得了ice家族的兩個新基因，ice-2和ice-5。通過試驗(yàn)證明ice-2和ice-5都與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)