病毒感染和高溫處理對(duì)家蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、家蠶是鱗翅目昆蟲的模式種，家蠶基因組全序列完成后，有關(guān)家蠶功能基因組學(xué)、發(fā)育與變態(tài)、性別決定、絲蛋白的高效合成、天然免疫等機(jī)制研究取得巨大進(jìn)展，但有關(guān)家蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)較少。動(dòng)物腸道中棲居著大量的微生物，腸道微生物在對(duì)食物的消化和營(yíng)養(yǎng)的吸收過(guò)程中起非常重要的作用。早期研究者通過(guò)傳統(tǒng)的純培養(yǎng)的方法對(duì)家蠶腸道微生物做了初步的研究；隨著對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，有學(xué)者利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物，采用變性梯度凝膠電泳（DGGE

2、）的方法對(duì)家蠶腸道菌群做進(jìn)一步研究。由于自然界絕大多數(shù)菌難以人工培養(yǎng)，DGGE法也存在缺陷，不能全面深入地檢測(cè)出家蠶腸道微生物。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已成為研究腸道微生物種群的關(guān)鍵技術(shù)，因此本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)調(diào)查家蠶腸道細(xì)菌的多樣性及豐度，希望為更全面地理解腸道微生物與家蠶間的相互關(guān)系提供新的數(shù)據(jù)。家蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)受性別、發(fā)育、飼料及環(huán)境等多種因素的影響，腸道微生物的失衡，往往導(dǎo)致腸道細(xì)菌性疾病的發(fā)生，同時(shí)誘導(dǎo)家蠶產(chǎn)生免疫響應(yīng)，并

3、引起免疫通路相關(guān)基因及抗菌肽基因的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的改變，反過(guò)來(lái)又影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成。
　　為了探討家蠶腸道微生物菌群對(duì)病毒感染、高溫處理的響應(yīng)規(guī)律，解析腸道微生物與病毒感染、家蠶免疫通路基因表達(dá)間的互作，分析家蠶進(jìn)化過(guò)程中腸道微生物的變化，本研究分別調(diào)查了家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)、家蠶濃核病毒(BmBDV)感染以及高溫刺激對(duì)五齡家蠶腸道細(xì)菌種群的變化，分析了家蠶腸道細(xì)菌之間的互作，初步研究了家蠶腸道菌群變化與病毒感染、

4、高溫刺激、家蠶基因表達(dá)之間的相互關(guān)系，并研究了家蠶與野桑蠶腸道細(xì)菌種群的差異。相關(guān)研究結(jié)果為全面理解家蠶腸道微生物提供了新的數(shù)據(jù)。
　　1.BmCPV感染對(duì)家蠶腸道菌群的影響
　　為了調(diào)查正常家蠶腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成及感染BmCPV后的變化，按感染病毒后正常飼養(yǎng)24h，72h和144h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集五齡家蠶腸道內(nèi)容物，根據(jù)16S rRNA基因的焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)分析各感染時(shí)期的腸道細(xì)菌的組成和豐度。結(jié)果顯示，在正常雌性和雄性家蠶腸

5、道中分別發(fā)現(xiàn)147和135個(gè)細(xì)菌屬，在感染BmCPV雌性和雄性家蠶腸道中分別發(fā)現(xiàn)113和103個(gè)細(xì)菌屬?？傮w來(lái)講，感染BmCPV以后，家蠶腸道細(xì)菌多樣性明顯降低，但是屬于革蘭氏陽(yáng)性菌的腸球菌屬(Enterococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的豐度增加，推測(cè)感染BmCPV后的這種細(xì)菌屬豐度的變化與家蠶的免疫系統(tǒng)反應(yīng)有關(guān)。優(yōu)勢(shì)菌屬的豐度相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腸球菌屬的豐度與其它的優(yōu)勢(shì)菌屬成負(fù)相關(guān)。
　　2.BmB

6、DV感染對(duì)家蠶腸道菌群的影響
　　為了探討 BmBDV感染對(duì)家蠶腸道菌群的影響及可能的作用機(jī)制，五齡起蠶人工感染BmBDV后，按感染病毒后正常飼養(yǎng)48h，96h，144h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集感染家蠶及正常家蠶的中腸內(nèi)容物及中腸，利用16S rRNA基因的Illumina miseq sequencing數(shù)據(jù)對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，BmBDV感染家蠶腸道中菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照家蠶差異較大，菌群多樣性在感染后正常飼養(yǎng)48h、96h變化不大，

7、而144h明顯低于正常家蠶。感染 BmBDV后，腸球菌屬比例逐漸增加，分類不明菌屬Incertae_Sedis的比例在感染后96h時(shí)達(dá)到最高，乳球菌屬（Lactococcus）的比例減少。主成分分析結(jié)果顯示，腸球菌豐度與大部分優(yōu)勢(shì)細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)，其中Anderseniella、Incertae_Sedis、反硝化細(xì)菌（Simplicispira）及腸球菌屬豐度增加很可能與感染BmBDV有關(guān)。熒光定量分析結(jié)果顯示，BmBDV感染后期，免疫系

8、統(tǒng)Toll、IMD和JAK/STAT通路相關(guān)基因表達(dá)量升高，同時(shí)誘導(dǎo)中腸抗菌肽（攻擊素attacins，防御素defensin，天蠶素cecropins）的表達(dá),感染后144h時(shí)腸道中的腸球菌屬豐度增加與家蠶 Spatzle（Bmspz）、肽聚糖識(shí)別蛋白（BmPGRP-LE和BmPGRP-LB）基因表達(dá)量成正比，推測(cè)BmBDV感染導(dǎo)致腸球菌豐度增加，進(jìn)而激活Toll及IMD通路。
　　3.短暫高溫處理對(duì)家蠶腸道菌群的影響
　

9、　有關(guān)高溫對(duì)家蠶腸道微生物種群、基因表達(dá)的影響研究較少。本研究利用16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)研究了短暫高溫處理(37?C,8h)后正常飼養(yǎng)48、96、144h的家蠶腸道細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，同時(shí)用 qPCR檢測(cè)了家蠶免疫信號(hào)通路重要基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,高溫處理的家蠶腸道細(xì)菌多樣性增加，腸球菌屬、泛菌屬（Pantoea）、Incertae_Sedis、Escherichia-Shigella、Anderseniella和不動(dòng)桿菌屬（

10、Acinetobacter）的豐度變化幅度較大，表明它們對(duì)高溫處理較敏感。PCA分析顯示，腸球菌屬與葡萄球菌屬的豐度與其它優(yōu)勢(shì)菌成負(fù)相關(guān)。物種-宿主基因表達(dá)矩陣分析結(jié)果顯示，在健康家蠶樣品中 Bmspz表達(dá)水平與腸球菌屬和葡萄球菌屬的豐度成負(fù)相關(guān)，與其它優(yōu)勢(shì)菌成正相關(guān)（除貪食菌屬（Variovorax）外）），Dicer-2基因（Bmdrc-2）的表達(dá)水平與腸球菌屬和葡萄球菌屬豐度成正相關(guān)；在高溫處理的家蠶樣品中，貪食菌屬的豐度與 Bm

11、spz表達(dá)水平成正相關(guān)，腸球菌屬、Escherichia-Shigella、Incertae_Sedis、Anderseniella、不動(dòng)桿菌屬的豐度與 Bmspz表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)，與Bmdrc-2、BmPGRP-LE、BmPGRP-LB成正相關(guān)。這些結(jié)果為理解高溫-家蠶腸道細(xì)菌-家蠶基因表達(dá)間的關(guān)系提供了新的線索。
　　4.野蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)
　　野桑蠶(Bombyx mandarinaLeech)是家蠶的祖先，為了分析家蠶

12、馴化對(duì)腸道微生物種群的影響，本研究對(duì)野桑蠶/家蠶五齡后期腸道細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA基因的高通量測(cè)序，結(jié)果顯示，野桑蠶中腸球菌屬的豐度(69.73％)明顯高于家蠶(48.99%)，罕見(jiàn)菌屬(Advenella)在野蠶腸道細(xì)菌的比例為11.54%，而在家蠶中沒(méi)有檢測(cè)到；乳球菌屬（Lactococcus），芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）在正常家蠶腸道細(xì)菌的占比分別為17.73%、5.02%和1.61%