家蠶濃核病毒中國(鎮(zhèn)江)株基因組的克隆與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶對濃核病毒的拯救.pdf

1、家蠶濃核病毒(Bombyx mori Densovirus，BmDNV)屬于細(xì)小病毒科濃核病毒屬，與其它昆蟲細(xì)小病毒感染昆蟲體內(nèi)多種組織不同，只感染家蠶中腸上皮組織的圓筒型細(xì)胞 。自從20世紀(jì)70年代日本學(xué)者證實(shí)家蠶濃核病是由于濃核病毒感染引起的以來，已經(jīng)分離得到了多個(gè)株系。根據(jù)它們在血清學(xué)、理化特性、品種感受性和病理特征等方面的差異，分為BmDNV-1（伊那株）和BmDNV-2（以山梨株為代表）。家蠶不同品種對濃核病毒的抵抗性差異很大

2、，有些品種完全不感染，但不同的蠶品種對各種濃核病毒的抵抗性也不相同。BmDNV-2病毒基因組包含2條大小分別為6.6Kb（VD1）和6.1Kb（VD2）的單鏈DNA分子，并且末端缺少形成回文結(jié)構(gòu)的序列；但2個(gè)DNA分子的兩個(gè)末段有53nt的共有反向重復(fù)序列（ITRs），每個(gè)病毒顆粒中只含有2條DNA分子中的一條。 家蠶濃核病毒中國（鎮(zhèn)江）株(Bombyx mori Densovirus Zhenjiang Strain，BmDN

3、V-Z)，與BmDNV-2相似，病毒基因組為兩種不同的單鏈DNA（VD1和VD2），病毒粒子中只含有兩種DNA分子中的一種。因此，BmDNV-Z和BmDNV-2應(yīng)為兩種包含不同DNA病毒粒子的混合物。目前，兩種DNA的核苷酸序列已經(jīng)測定,其中VD1上含有3個(gè)ORF,可以編碼病毒粒子的全部結(jié)構(gòu)蛋白,而VD2上只有一個(gè)ORF,不含有編碼全部結(jié)構(gòu)蛋白的遺傳信息，推測兩種病毒粒子在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中可能具有互為輔助病毒的作用。 本研究

4、采用PCR方法，從BmDNV-Z感染蠶中腸總DNA中擴(kuò)增得到BmDNV-Z的兩種DNA，克隆到質(zhì)粒pGEM-T和pMD-VD2構(gòu)建了重組質(zhì)pGEM-VD1和pMD-VD2。測定了該基因組核苷酸序列，并與已報(bào)道的家蠶濃核病毒中國（鎮(zhèn)江）株全基因組進(jìn)行同源性比較。克隆獲得的BmDNV-Z基因組經(jīng)雙向測序，測序結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank(VD1 EU623082，VD2 EU623083)。VD1的核苷酸數(shù)目為6543bp,其序列與已報(bào)道序列

5、（GenBank 登錄號DQ017268、AB033596）的同源性分別為99.9％，98.3％。VD2的核苷酸數(shù)目為6024bp,序列與已報(bào)道序列DQ017269的同源性分別為99.9％，不僅核苷酸數(shù)目增加了兩個(gè)，而且其中位于第2824核苷酸的一個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)發(fā)生了突變，導(dǎo)致VD2基因組僅含有兩個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，而已報(bào)到的序列(DQ017269)上有3個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物（5’-TGGCAA

6、CTGGAACTGGAGTA-3’和5’-ATATACTTGGTTCCAATTAC-3’）對該突變點(diǎn)兩側(cè)(2398bp-3551bp)的序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，結(jié)果證實(shí)了該突變的發(fā)生。VD2的核苷酸序列與日本山梨株DNV（S78547）的同源性為97.9％，其Hind III酶切位點(diǎn)的突變與日本山梨株DNV一致。采用DEAE-dextran轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pGEM-VD1和pMD-VD2分別導(dǎo)入和等量混合后（pGEM-VD1+pMD-V