家蠶二分濃核病毒DNA聚合酶啟動(dòng)子P97的相關(guān)研究.pdf

1、家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV)之前又稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型(Bombyx mori Densovirus typeⅡ，BmDNV-Ⅱ)。該病毒能使家蠶罹患濃核癥，是首例動(dòng)物二分DNA病毒。它主要感染家蠶中腸柱狀上皮細(xì)胞，造成家蠶的濃核癥。該病毒是直徑為22nm左右的二十面體球形顆粒，擁有獨(dú)立包裝的雙分子單鏈線性DNA(ssDNA)基因組，并且能夠編碼自身的DNA聚合酶。2012年國(guó)際病毒分

2、類委員會(huì)(ICTV)專門為該病毒設(shè)立了二分DNA病毒科，二分濃核病毒屬，并將其定為該屬的代表種。BmBDV是目前已知唯一的編碼DNA聚合酶的ssDNA病毒，DNA聚合酶的表達(dá)對(duì)該病毒的復(fù)制至關(guān)重要。而DNA聚合酶的相關(guān)研究，對(duì)于進(jìn)一步的了解該病毒的復(fù)制機(jī)制具有重要意義。本研究主要是通過使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)利用共轉(zhuǎn)染的方法，對(duì)該病毒DNA聚合酶啟動(dòng)子的活性區(qū)域以及病毒或者宿主中存在的蛋白對(duì)DNA聚合酶啟動(dòng)子活性的影響進(jìn)行研究。
　

3、　 本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:
　　 (1)病毒DNA聚合酶啟動(dòng)子的克隆、活性鑒定及生物信息學(xué)分析。本研究中使用帶有接頭的引物，以病毒粒子作模板，擴(kuò)增得到帶有該啟動(dòng)子片段的螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體，并通過與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法確定該病毒的DNA聚合酶啟動(dòng)子區(qū)域位于其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游286bp。此外，使用轉(zhuǎn)錄元件分析軟件TESS進(jìn)行分析，確定該片段中包含TATA box，SP1結(jié)合位點(diǎn)等啟動(dòng)子特征性序列。
　　

4、(2)確定病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)對(duì)DNA聚合酶啟動(dòng)子活性的影響。分別構(gòu)建帶有非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2的瞬時(shí)表達(dá)載體，通過與構(gòu)建的帶有P97啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶載體及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)共轉(zhuǎn)染的蛋白的表達(dá)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示BmBDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2均下調(diào)啟動(dòng)子活性分別達(dá)到14.3％和15.9％。
　　 (3)確定病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP對(duì)DNA聚合酶啟動(dòng)子活性的影響。通過構(gòu)建帶有

5、VP的瞬時(shí)表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染的方式，確定VP對(duì)該啟動(dòng)子活性的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示VP蛋白的表達(dá)能夠顯著的增強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性，使其活性升高了33.6％。
　　 (4)確定宿主轉(zhuǎn)錄因子BmTWIST是否對(duì)該病毒DNA聚合酶啟動(dòng)子活性的影響。通過與上述相同的實(shí)驗(yàn)方法，將構(gòu)建的BmTWIST瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒與PGL3-P97及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，確定BmTWIST蛋白對(duì)P97啟動(dòng)子活性的影響。檢測(cè)結(jié)果確定宿主家蠶BmTWIST蛋白的表達(dá)對(duì)DNA聚合