家蠶山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子的特性分析.pdf

1、山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）是山梨醇轉(zhuǎn)化為糖原的關(guān)鍵酶，家蠶卵中山梨醇含量的變化與卵期滯育的發(fā)動(dòng)、持續(xù)和停止有著密切的平行關(guān)系。家蠶有3個(gè)SDH基因，分別為BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b。雖然有不少有關(guān)家蠶山梨醇脫氫酶的研究報(bào)道，但他們研究重點(diǎn)主要集中在蛋白酶的表達(dá)上，并未發(fā)現(xiàn)有對(duì)這3個(gè)SDH基因啟動(dòng)子特性進(jìn)行研究的相關(guān)文獻(xiàn)。為了探究BmSDH是如何參與調(diào)控二化性家蠶滯育的分子

2、機(jī)制，本文對(duì)家蠶二化性品種“秋豐”3個(gè)SDH基因相同長(zhǎng)度啟動(dòng)子，BmSDH-2a不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子以及激素對(duì)BmSDH-2a啟動(dòng)子活性影響進(jìn)行了研究分析，取得如下主要結(jié)果。
　　1.家蠶體內(nèi)山梨醇脫氫酶活性主要來(lái)自BmSDH-2a的表達(dá)
　　根據(jù)家蠶3個(gè)山梨醇脫氫酶基因所在的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以二化性（bivoltine，bvt）品種秋豐基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到3個(gè)BmSDH約1.0Kb的啟動(dòng)子片段；以pGL

3、3.0 basic質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建由BmSDH啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)熒光素酶報(bào)告基因（luc）表達(dá)載體 pGL3-BmSDH-1-bvt-1074，pGL3-BmSDH-2a-bvt-1082和pGL3-BmSDH-2b-bvt-1175；分別轉(zhuǎn)染家蠶卵巢來(lái)源的BmN細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載的BmN細(xì)胞為對(duì)照，分析luc表達(dá)水平，并以此衡量BmSDH啟動(dòng)子片段的活性，結(jié)果顯示：同樣長(zhǎng)度的BmSDH-2a啟動(dòng)子活性明顯高于BmSDH-2b和BmSDH

4、-1的啟動(dòng)子活性，分別是后者的9.7倍和21.0倍，暗示家蠶體內(nèi)山梨醇脫氫酶活性主要來(lái)自BmSDH-2a的表達(dá)。
　　2.BmSDH-2a基因啟動(dòng)子-355-1082bp之間存在負(fù)調(diào)控元件
　　為了進(jìn)一步研究 BmSDH-2a基因啟動(dòng)子的特性，從 BmSDH-2a基因啟動(dòng)子的5’端截短處理，分別克隆二化性品種BmSDH-2a674bp和355 bp的啟動(dòng)子片段，構(gòu)建不同長(zhǎng)度的BmSDH-2a啟動(dòng)子片段控制的報(bào)告質(zhì)粒pGL3-

5、BmSDH-2a-bvt-674和pGL3-BmSDH-2a-bvt-355，并與pGL3-BmSDH-2a-bvt-1082分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，結(jié)果顯示：BmSDH-2a的355bp啟動(dòng)子活性明顯高于674 bp和1082bp的啟動(dòng)子，分別是它們的1.3倍和3.3倍，提示在BmSDH-2a啟動(dòng)子-355 bp～-674 bp和-674 bp～-1082bp之間存在負(fù)調(diào)控元件。
　　3.不同的昆蟲(chóng)激素對(duì)BmSDH-2a基因啟動(dòng)子活

6、性的影響存在差異
　　以長(zhǎng)度為1082bp的BmSDH-2a基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，并分別在培養(yǎng)基中添加滯育激素、保幼激素和蛻皮激素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)使用不同濃度滯育激素進(jìn)行處理的時(shí)，BmSDH-2a基因啟動(dòng)子的活性與滯育激素濃度為0時(shí)的活性并沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明滯育激素不能直接調(diào)節(jié)BmSDH的表達(dá)；當(dāng)保幼激素濃度為2，4，6μg/mL時(shí)，啟動(dòng)子的活性顯著降低，分別是濃度為0時(shí)的0.67，0.64和0.67倍；當(dāng)