家蠶組織蛋白酶D基因啟動子相關(guān)功能序列的分析.pdf

1、組織蛋白酶D基因在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中起著非常重要的調(diào)控作用。為探討家蠶組織蛋白酶D(BmCatD)基因的調(diào)控分子機制,本研究以BmCatD基因啟動子為研究對象,以能感染AcMNPV的家蠶為研究材料,通過構(gòu)建含BmCatD調(diào)控元件啟動子的雙熒光AcMNPV表達載體,結(jié)合Over-lap PCR基因定點突變方法,研究了該基因啟動子調(diào)控元件在家蠶體內(nèi)的表達活性。獲得如下研究結(jié)果:
　　確定了該基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點,該位點位于起始密碼子

2、ATG上游-90bp處。選定轉(zhuǎn)錄起始位點前約1500bp的啟動子序列為研究對象,生物信息學分析表明,BmCatD基因啟動子中有3個蛻皮激素受體調(diào)控元件(ecdysone response element,EcRE):EcRE1,TTCGATTGACA(-109bp~-99bp);EcRE2,TTTAACTGAAA(-836bp~-826bp)和EcRE3,TTGGAATGAAA(-856bp~-846bp)。通過Over-lapPCR基

3、因定點突變方法,對EcREs調(diào)控元件相對保守堿基進行突變,將突變的啟動子片段克隆到雙熒光AcMNPV表達載體中,并檢測在家蠶脂肪體中的表達活性,結(jié)果表明,突變后的3個EcREs對BmCatD啟動子的表達活性都呈下調(diào)影響,說明EcREs元件參與了BmCatD啟動子活性的調(diào)控,且臨近轉(zhuǎn)錄起始位點的EcRE1元件調(diào)控作用影響最大。
　　通過對該基因啟動子序列5’端順次缺失,研究了啟動子長度對BmCatD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用影響。對該基因啟

4、動子+91―-1363bp序列進行5’端順次缺失,用PCR方法構(gòu)建了6個不同長度的啟動子序列片段:P1214(-1214bp)、P925(-925bp)、P801(-801bp)、P501(-501bp)、P234(-234bp)和P95(-95bp)。再分別將上述啟動子片段克隆到雙熒光rAcMNPV供體質(zhì)粒中進行病毒表達并接種家蠶,檢測5齡第4天熒光素酶報告基因在家蠶脂肪體中的表達活性。結(jié)果表明,長短不同的啟動子之間,其活性值有差異,