東方粘蟲中腸胰蛋白酶基因上游啟動(dòng)子核心序列的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、隨著人們對(duì)食品安全以及綠色農(nóng)業(yè)的持續(xù)深入的關(guān)注，對(duì)安全使用農(nóng)藥問(wèn)題的認(rèn)識(shí)也越來(lái)越深刻，因此，利用天然產(chǎn)物研究開發(fā)新型農(nóng)藥成了近年的熱點(diǎn)之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，杠柳新苷類化合物對(duì)東方粘蟲具有一定的殺蟲活性，并且可以上調(diào)昆蟲體內(nèi)胰蛋白酶的表達(dá)，使其發(fā)生過(guò)分表達(dá)分泌的現(xiàn)象，超出蟲體自身的生命代謝水平，從而可能使其自身的器官和組織被該類酶水解破壞，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。但是，目前的研究尚未明確該類化合物如何產(chǎn)生這種效應(yīng)，對(duì)其殺蟲機(jī)理也未有明確的研究。<

2、br>　　1.東方粘蟲中腸胰蛋白酶基因啟動(dòng)子的缺失克隆
　　本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)粘蟲中腸胰蛋白酶基因啟動(dòng)子上游的序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)初步預(yù)測(cè)的結(jié)果，設(shè)計(jì)出7段缺失引物，對(duì)靶標(biāo)啟動(dòng)子進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，并將得到質(zhì)粒重組到熒光素酶報(bào)告基因載體，共同轉(zhuǎn)染至昆蟲Sf21細(xì)胞系中，瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)相對(duì)熒光活性，從而比較出各段啟動(dòng)子活性。試驗(yàn)結(jié)果表明靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)在-1003/-788和-274/-188間可能包含某些

3、對(duì)胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且在-1003/-788之間可能存在轉(zhuǎn)錄激活因子，在-274/-188之間可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子。
　　2.東方粘蟲中腸胰蛋白酶基因啟動(dòng)子的突變克隆
　　采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法，結(jié)合缺失片段啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱，參考各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能，預(yù)測(cè)出符合先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能存在的6個(gè)可能潛在的轉(zhuǎn)錄因子Zeste、Ubx、Myod、Cf2、SMAD、STAT的結(jié)合位點(diǎn)，并將其可能的結(jié)合

4、位點(diǎn)序列突變，設(shè)計(jì)出6對(duì)突變引物，利用PCR技術(shù)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行突變克隆，構(gòu)建包含有突變啟動(dòng)子片段質(zhì)粒的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至Sf21細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)后比較其各段啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)突變Myod和Cf2的結(jié)合位點(diǎn)序列后，啟動(dòng)子活性與空白對(duì)照組有差異，從而推測(cè)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能存在于粘蟲體內(nèi)，并對(duì)于粘蟲中腸胰蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要作用。
　　3.杠柳化合物對(duì)靶標(biāo)基因啟動(dòng)子的影響
　　本試驗(yàn)為了探究杠柳新苷類化合物是否可以直接作用于靶標(biāo)

5、啟動(dòng)子，將供試藥物利用DMSO溶解配制成不同濃度梯度的藥劑，在由啟動(dòng)子全長(zhǎng)構(gòu)建的熒光素表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的Sf21細(xì)胞中直接用不同濃度的藥劑孵育5h，待表達(dá)完成后與空白對(duì)照組比較啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，粘蟲中腸胰蛋白酶基因啟動(dòng)子在杠柳新苷T低濃度處理下活性均有所降低，且隨著杠柳新苷T處理濃度的升高，啟動(dòng)子活性降低，表明杠柳新苷T對(duì)胰蛋白酶基因啟動(dòng)子活性有影響。
　　本研究通過(guò)對(duì)粘蟲中腸的胰蛋白酶基因進(jìn)行了分析與預(yù)測(cè)，與空白對(duì)照的啟動(dòng)子活性