水稻OsCPK9基因啟動(dòng)子的克隆及功能研究.pdf

1、鈣離子作為第二信使，在植物響應(yīng)逆境脅迫和生長(zhǎng)、發(fā)育的過(guò)程中扮演著重要角色。目前在高等植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有三類(lèi)鈣信號(hào)感受器，其中鈣依賴(lài)性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)是一種響應(yīng)性感受器，它既是Ca2+的感受器，又是效應(yīng)器，CDPKs廣泛分布于植物體內(nèi)。近年來(lái)隨著人們對(duì)CDPK研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，CDPK與植物的發(fā)育、激素應(yīng)答、代謝調(diào)節(jié)、逆境脅迫以及防御反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)

2、。研究發(fā)現(xiàn)，干旱、低溫脅迫以及稻瘟病病原菌侵染等均能上調(diào)OsCPK9基因的表達(dá)，顯示OsCPK9在水稻的生物和非生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用。
　　啟動(dòng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游、能被RNA聚合酶識(shí)別、并與之結(jié)合從而啟動(dòng)下游基因表達(dá)的一段特異性DNA序列，是植物重要的順式作用元件之一。啟動(dòng)子決定基因在植物體內(nèi)表達(dá)的時(shí)空特異性，被稱(chēng)為基因精確表達(dá)與調(diào)控的“分子開(kāi)關(guān)”。為了更好地研究OsCPK9基因的表達(dá)調(diào)控模式和作用機(jī)理。我們成功克

3、隆了水稻OsCPK9基因上游約2kb的序列，作為其啟動(dòng)子區(qū)，利用植物順式作用調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫(kù)（Database of Plant Cis-acting Regulatory DNAElements,PLACE）進(jìn)行順式表達(dá)元件分析，并且成功地構(gòu)建了POsCPK9::GUS表達(dá)載體，研究其表達(dá)特性，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）從水稻栽培品種日本晴基因組中克隆了OsCPK9基因上游2114bp的序列，作為OsCPK9基因啟動(dòng)子區(qū)。生物

4、信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有多個(gè)與植物生長(zhǎng)發(fā)育、各種生物與非生物逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，暗示OsCPK9基因啟動(dòng)子可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)脅迫過(guò)程等多種信號(hào)通路中扮演著重要作用。
　?。?）成功的構(gòu)建POsCPK9::GUS真核表達(dá)載體，利用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)轉(zhuǎn)化野生型煙草WT4，經(jīng)過(guò)GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，POsCPK9驅(qū)動(dòng)的GUS基因在煙草莖和葉片中表達(dá)水平較高，在花藥中表達(dá)次之，在根、柱頭、花瓣、花萼中有少量表達(dá)，GUS活性測(cè)定結(jié)果

5、與組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明POsCPK9具有啟
　　動(dòng)子活性，且表達(dá)在不同的組織中存在著差異性。
　?。?）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析表明，植物激素脫落酸（ABA）和滲透物質(zhì)PEG-6000對(duì)POsCPK9驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，經(jīng)過(guò)3μmol/LABA和20％PEG6000處理的煙草葉片，其GUS活性較未誘導(dǎo)葉片均有不同程度的提高。
　?。?）利用構(gòu)建成功的POsCPK9::GUS真核表