短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因啟動(dòng)子的功能研究.pdf

1、短小芽孢桿菌UN-31-C-42是一株產(chǎn)生具有脫毛功能的堿性蛋白酶的菌株。該菌株的堿性蛋白酶基因編碼區(qū)已被克隆，本研究通過TAIL--PCR(Thermalasymmetric interlaced PCR)擴(kuò)增得到堿性蛋白酶基因編碼區(qū)上游的啟動(dòng)子片段Papr，經(jīng)測(cè)序、序列拼接及比對(duì)分析等對(duì)Papr進(jìn)行了鑒定。該啟動(dòng)子片段長(zhǎng)797bp，在片段的5’端存在一個(gè)開放閱讀框，可能為磷酸甘油酸變位酶基因的部分編碼區(qū)，故堿性蛋白酶基因啟動(dòng)子的長(zhǎng)度

2、為378 bp。通過對(duì)啟動(dòng)子序列的分析，推測(cè)出了該啟動(dòng)子的保守序列及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。對(duì)啟動(dòng)子的順序缺失研究證實(shí)基因起始密碼子上游160bp的DNA片段包含完整的啟動(dòng)功能片段。 根據(jù)Papr序列設(shè)計(jì)引物，從短小芽孢桿菌UN-31-C-42基因組中擴(kuò)增獲得了包含啟動(dòng)子、信號(hào)肽、前肽、成熟肽及終止子的完整的堿性蛋白酶基因片段WAp。將WAp插入大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體pSUGV4中，構(gòu)建了堿性蛋白酶基因表達(dá)質(zhì)粒pSUBpWAp。

3、將pSUBpWAp分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600以及短小芽孢桿菌UN-31-C-42中進(jìn)行表達(dá)。包含了質(zhì)粒pSUBpWAp的大腸桿菌JM109細(xì)胞內(nèi)外均檢測(cè)不到堿性蛋白酶活性。在枯草芽孢桿菌WB600中的表達(dá)則可在胞外檢測(cè)到堿性蛋白酶活性，證明啟動(dòng)子Papr可在枯草芽孢桿菌中啟動(dòng)堿性蛋白酶基因的表達(dá)，產(chǎn)生的堿性蛋白酶活性最高達(dá)到466.5U/ml，與包含Bp53啟動(dòng)子的堿性蛋白酶基因表達(dá)質(zhì)粒pSUBpAp比較，酶活提

4、高2倍。pSUBpWAp在短小芽孢桿菌UN-31-C-42中也能表達(dá)產(chǎn)生堿性蛋白酶活性，但宿主菌的蛋白酶產(chǎn)量并未提高。利用細(xì)菌的16s rDNA通用引物從短小芽孢桿菌UN-31-C-42基因組中擴(kuò)增到16s rDNA片段，將該片段插入載體pMD18-T中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD16s。從載體pSUGV4中擴(kuò)增到卡那霉素抗性基因片段，與堿性蛋白酶基因一同插入質(zhì)粒pMD16s的16s rDNA片段中，構(gòu)建整合型質(zhì)粒。擬將該質(zhì)粒整合至短小芽孢桿