氧化葡糖桿菌山梨醇代謝相關(guān)基因研究.pdf

1、目的:
　　目前生產(chǎn)維生素C(Vitamin c，Vc)的主要方法為我國上世紀(jì)70年代首創(chuàng)的Vc二步發(fā)酵法。兩步發(fā)酵法需通過兩次發(fā)酵及三種微生物的共同作用，存在發(fā)酵工藝復(fù)雜和微生物代謝污染等問題，目前Vc生產(chǎn)工藝發(fā)展的主流方向是將兩步發(fā)酵簡化為一步單菌發(fā)酵。本實驗室在前期工作中，通過在負(fù)責(zé)醇糖轉(zhuǎn)化的氧化葡糖桿菌中導(dǎo)入產(chǎn)酸基因簇實現(xiàn)了由D-山梨醇到2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)的一步單

2、菌發(fā)酵，但醇酸轉(zhuǎn)化率較低。本課題對山梨醇相關(guān)基因及代謝途徑進行了研究，嘗試通過增強主路代謝和阻斷旁路代謝兩方面來提高一步菌醇酸轉(zhuǎn)化率。
　　方法:
　　(1)選取了四種常用和一種文獻報道的氧化葡糖桿菌強啟動子，同時通過氧化葡糖桿菌轉(zhuǎn)錄組測序選取了轉(zhuǎn)錄水平最高的三種啟動子，構(gòu)建山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達載體，電擊轉(zhuǎn)化氧化葡糖桿菌比較2-KGA產(chǎn)量。
　　(2)根據(jù)基因組注釋和轉(zhuǎn)錄組差異分析并結(jié)合文獻調(diào)研預(yù)測了12種可能

3、參與山梨醇代謝的基因，包括3種山梨醇脫氫酶(SLDH)、3種山梨糖還原酶(SR)、3種木糖醇脫氫酶(XDH)和3種酮古龍酸還原酶(HADH)，通過課題組建立的快速高效同源重組法對這些酶的編碼基因進行一敲除，分別以山梨醇、山梨糖為碳源對敲除菌進行生長及糖酸代謝水平評價。選擇表型變化大的敲除菌進行基因回補。部分敲除菌導(dǎo)入山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達載體，比較基因敲除前后菌株醇糖代謝及2-KGA產(chǎn)量的變化。同時，為建立基因無痕敲除操作系統(tǒng)以實

4、現(xiàn)多個相關(guān)基因的敲除，對upp基因進行敲除及回補工作，通過Tn5轉(zhuǎn)座突變篩選其他未知的與旁路代謝相關(guān)基因。
　　結(jié)果:
　　(1)在試管及搖瓶中培養(yǎng)，PcsbD啟動子與天然啟動子相比產(chǎn)酸量分別提高15％和19％。
　　(2)目前已分別在氧化葡糖桿菌H24和1.637中成功敲除了10個和11個基因。分別以山梨醇、山梨糖為碳源對敲除菌進行評價發(fā)現(xiàn)，敲除菌H24Δsr3以山梨糖為碳源時前期生長緩慢，而敲除菌1.637Δsr3

5、在兩種碳源中前期生長緩慢;H24和1.637的sr1、sr2、sr3敲除菌以山梨醇為碳源時山梨糖的積累增多，其中1.637Δsr3敲除菌山梨糖積累最多，1.637Δsr3的回補實驗結(jié)果進一步證明sr3基因影響菌體生長及山梨糖利用。導(dǎo)入山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達載體后，1.637Δsr3產(chǎn)酸量高于野生菌1.637。
　　(3)完成了氧化葡糖桿菌upp基因敲除及回補，構(gòu)建pBBR1MCS5-sndhsdh/1.637重組菌株Tn5突