食管癌細胞EC-1DNA聚合酶β啟動子堿基突變對其轉錄活性的影響.pdf

1、授予單位代碼:學號或申請?zhí)?10459200612026071010002文學論大位州學鄭士碩(科學學位)食管癌細胞EC一IDNA聚合酶p啟動子堿基突變對其轉錄活性的影響院系名稱:基礎醫(yī)學院學位類別:醫(yī)學專業(yè)名稱:生物化學與分子生物作者姓名:王歡導師姓名、職稱:李月白教授二零零九年五月鄭州大學2009屆碩士學位論文食管癌細胞硯一IDNA聚合酶p啟動子堿基突變對姿軍最活性的影響p啟動子報告基因載體、突變型DNApolp啟動子報告基因載體在

2、腫瘤細胞(EC一1和Eca9706細胞)和正常永生化細胞中啟動子活性強弱，以此探討食管癌細胞株EC一1中DNApolp啟動子的突變形式對其啟動子轉錄活性的影響，以證實腫瘤細胞中是否具有促進DNApolp啟動子活性增加的作用因素。材料與方法1.提取食管癌細胞株EC一1和永生化細胞293T細胞基因組ONA:按照AXYGEN質粒小量提取試劑盒的操作規(guī)程提取2種細胞基因組DNA。2.擴增食管癌細胞株EC一1和293丁細胞DNAPop基因啟動子片

3、段并確定突變位點:設計擴增polp基因啟動子引物，PCR擴增食管癌細胞株EC一1和293T細胞polp基因核心啟動子片段，與pGEM一TEasy質粒連接，然后轉化感受態(tài)細菌筋子~sa，通過?；パa實驗以及采用通用引物T7SP6行PCR以鑒定重組子pGEM一T一p。lppromoter是否轉入。正反雙向測序后，采用DNASIS、OM工GA軟件將測序結果與GenBank查到DNApolp啟動子序列進行同源性比較，分析確定食管癌細胞株EC一1和

4、293T細胞是野生型或突變型polp啟動子并確定突變位點。3.構建含食管癌細胞株〔C一1和永生化細胞293T細胞pep基因啟動子的熒光素酶報告基因載體并鑒定:將已提取并測序正確的重組T載體(pGEM一T一polppromoter)和熒光素酶報告基因載體poL3一neo一enhaneer，用腸01和去刀刀djl分別做雙酶切，回收純化的雙粘Polp啟動子目的片段，亞克隆至雙粘線性PGL3一neo一enhancer熒光素酶報告基因載體，得到重

5、組質粒pGL3一neo一polpPromoter。質粒pGL3一neo一polppromoter經(jīng)乃01和Hl’nd111雙酶切和PCR鑒定后，正反雙向測序以鑒定構建的含食管癌細胞株EC一1和永生化293T細胞polp基因啟動子的熒光素酶報告基因表達載體的正確性，并確認突變存在位點仍然正確。即構建成分別含永生化293T細胞和食管癌細胞株EC一IPolp基因啟動子的熒光素酶報告基因表達載體(pGL3一neo一293TpolpPromote