帶egfp報(bào)告基因的重組家蠶二分濃核病毒的初步研究.pdf

1、家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）是2012年新建二分DNA病毒科（family Bidnaviridae）的代表種，是首例動(dòng)物二分體病毒。BmBDV特異地感染家蠶中腸柱狀上皮細(xì)胞，感染家蠶表現(xiàn)出濃核病癥。BmBDV的病毒粒子，沒(méi)有囊膜包被，呈正二十面體型，直徑約22-24nm。BmBDV基因組包括兩個(gè)單鏈DNA分子，分別包裝到兩個(gè)病毒粒子中。DNA分子的末端有反向末端重復(fù)，里面沒(méi)有回文序列

2、，不能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，DNA不能像細(xì)小病毒采取滾環(huán)復(fù)制的方式。BmBDV自身編碼一個(gè)B家族DNA聚合酶，基因組末端可以形成“鍋柄形”結(jié)構(gòu)，可能采取類(lèi)似腺病毒的以蛋白為引物的DNA復(fù)制模式。BmBDV兼具濃核病毒及腺病毒的雙重特性，在作為載體方面有很大的潛能。
　　先前研究結(jié)果表明BmBDV基因組克隆線性化后轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了該病毒的拯救。在病毒拯救的基礎(chǔ)上，要研究BmBDV作為表達(dá)載體，首先要研究它是否具有容納外源基因的能力

3、。BmBDV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的啟動(dòng)子是一個(gè)早期啟動(dòng)子，在病毒感染的早期就有活性。BmBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP和次要結(jié)構(gòu)蛋白mCP，同非結(jié)構(gòu)蛋白的啟動(dòng)子活性相比，結(jié)構(gòu)蛋白的啟動(dòng)子活性更強(qiáng)。在本研究中，選擇報(bào)告基因egfp作為外源基因，插入到病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因、主要結(jié)構(gòu)蛋白基因以及次要結(jié)構(gòu)蛋白基因的編碼框中，構(gòu)建了BmBDV重組病毒。在細(xì)胞水平上對(duì)重組病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，并且對(duì)BmBDV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的感染性進(jìn)行了初步

4、探索。
　　1.病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因與egfp融合的重組病毒
　　BmBDV的非結(jié)構(gòu)蛋白ns1基因的啟動(dòng)子P5是一個(gè)早期啟動(dòng)子，在病毒感染的早期就能起始ns1基因的轉(zhuǎn)錄，所以我們首先選擇非結(jié)構(gòu)蛋白基因作為egfp插入的位點(diǎn)。本章中，將egfp基因插入到非結(jié)構(gòu)蛋白ns1基因的C末端，成功構(gòu)建了egfp基因與病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因融合的重組質(zhì)粒pVD1-NS1GFPf。線性重組病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，在生物學(xué)水平和分子生物學(xué)水平對(duì)

5、重組病毒進(jìn)行了鑒定。
　　2.病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因與egfp融合的重組病毒
　　VP蛋白是BmBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分，在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量很高，啟動(dòng)子活性比較強(qiáng)。本研究中egfp基因插入到vp基因的內(nèi)部以及C末端，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVD1-VP/GFP和pVD1-VPGFPf。將重組DNA從環(huán)形質(zhì)粒上釋放后轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，在細(xì)胞水平上對(duì)主要結(jié)構(gòu)蛋白融合報(bào)告基因的重組病毒進(jìn)行了鑒定。
　　3.病

6、毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白基因與egfp融合的重組病毒
　　除了VP蛋白之外，BmBDV還能編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白mCP，在本章研究中egfp基因插入到mCP基因內(nèi)部，成功構(gòu)建了次要結(jié)構(gòu)蛋白基因與egfp融合的重組質(zhì)粒pVD2-mCP/GFP。酶切后獲得的線性重組DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)水平鑒定，可以檢測(cè)到病毒DNA的復(fù)制和主要結(jié)構(gòu)蛋白VP的表達(dá)。
　　4.BmBDV對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染性的檢測(cè)
　　研究發(fā)現(xiàn)，BmBDV的

7、P5啟動(dòng)子在HeLa細(xì)胞中具有活性，就此我們研究了BmBDV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)情況。本研究中將線性化的BmBDV基因組以及構(gòu)建的帶egfp標(biāo)簽的重組病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分子水平上沒(méi)有檢測(cè)到病毒DNA的復(fù)制和主要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。該結(jié)果初步說(shuō)明BmBDV對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有感染性。
　　本研究最后得出結(jié)論，構(gòu)建重組BmBDV時(shí)報(bào)告基因和病毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白mCP基因融合時(shí)對(duì)病毒的影響最小，初步研究結(jié)果表明BmBDV對(duì)