家蠶Ssu72蛋白基因的初步研究.pdf

1、Ssu72(Suppresso.o.sua7-.clon.2)蛋白的命名源于它對酵母的sua7-1基因突變的抑制作用。該蛋白具有很高的保守性，但在細菌或者古細菌中沒有發(fā)現(xiàn)Ssu72的同源物，所以Ssu72蛋白很可能是真核生物所特有的一種蛋白質。目前關于Ssu72蛋白的研究有很多，推測它在真核生物RNA聚合酶II作用的轉錄過程中有可能具有重要的功能：涉及轉錄起始位點的選擇；具有磷酸酶的活性；與剪切和多聚腺苷酸化因子(cleavag.an.

2、polyadenylatio.factor.CPF)相結合；平衡轉錄的延長和終止等。但Ssu72蛋白確切的功能和作用機理仍不清楚。
　　 我們從本實驗室構建的家蠶蛹期cDNA文庫中篩選到一條序列，對其進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)此序列包含一個57.bp的開放閱讀框(ope.readin.frame，ORF)，編碼一個由192個氨基酸組成的蛋白，預測分子量為22.3.kDa，等電點為5.04。由于其所編碼的蛋白含有一個完整的Ssu72

3、保守結構域，且與其它物種的Ssu72蛋白有很高的同源性，所以將家蠶中的這個基因命名為BmSsu72。通過PCR擴增得到BmSsu72基因的完整ORF序列，將其插入到pET-28a(+)表達載體的Bam.I和Xh.I酶切位點之間，獲得重組質粒pET-28a(+)-BmSsu72。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，IPTG誘導表達含有His標簽的BmSsu72融合蛋白，分子量為25.9.kDa，與理論分子量大小一致。對重組菌超聲

4、破碎，用鎳親和柱純化得到較純的蛋白。用純化的蛋白作為抗原免疫一只雄性新西蘭大白兔，獲得多克隆抗血清，間接ELISA法測得抗體效價達1：12800以上。應用熒光定量PCR技術對家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個不同發(fā)育時期及五齡幼蟲的不同組織中BmSsu72的轉錄情況進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著家蠶的生長發(fā)育過程，BmSsu72基因的轉錄逐漸降低，五齡幼蟲各個組織中的轉錄以馬氏管和絲腺最高。利用Wester.blotting技術分析家蠶五齡幼蟲的氣管、絲