家蠶精巢特異性蛋白激酶基因Rm-TSSK的克隆和功能初步鑒定.pdf

1、蛋白激酶通過對蛋白底物絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的磷酸化而完成對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，這一過程在許多細(xì)胞活動中起著十分重要的作用，包括：細(xì)胞外信號傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)運輸、細(xì)胞周期進(jìn)程以及精子發(fā)生等。
　　 睪丸特異性蛋白激酶(Testis-specific serine/threonine kinase，TSSK)是首先在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)的，它是一個大家族，該家族有6個成員，是一類專一的在精子發(fā)生過程中起到重要作用的蛋白激酶。實驗證明這

2、類酶和睪丸組織的精子形成和分化有關(guān)。通過表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag，EST)方法，用人的TSSK2、TSSK4、TSSK6和小鼠(Mus musculus)的TSSKI、TSSK3、TSSK5的cDNA為探針在家蠶(Bombyx mori)GenBank EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)同源基因。通過在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫的同源性檢索，并進(jìn)行電子克隆，獲得一條家蠶精巢特異性蛋白激酶基因的序列，據(jù)此預(yù)測序列設(shè)計引物，成功地在

3、家蠶精巢組織中克隆了該基因完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），命名為Bm-TSSK（GenBank登錄號：JN159476）。序列分析及同源性比對表明：該基因序列長1402 bp，ORF為1041bp，推測編碼346個氨基酸殘基；該基因推導(dǎo)的氨基酸序列在進(jìn)化關(guān)系上與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、雄蜂(Bombus impatiens)、頂切葉蟻(Acromyrmexechinatior

4、)的親緣關(guān)系較近，相似性分別為81％、86%和85%。
　　 基于定量PCR和基因芯片的數(shù)據(jù)分析顯示Bm-TSSK在家蠶5齡第3天幼蟲的精巢特異性高表達(dá)，并對家蠶4齡時期,5齡時期和上蔟到蛹期各天數(shù)精巢組織做了表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，家蠶基因Bm-TSSK在4齡眠期的轉(zhuǎn)錄水平最高。由于該時期是家蠶精母細(xì)胞開始分化的高峰期，推測Bm-TSSK可能通過影響精母細(xì)胞的分化過程參與家蠶精子的形成。該基因在上蔟到蛹期階段的轉(zhuǎn)錄水平平穩(wěn)。

5、r>　　 本文通過采用RNAi的方法，抑制Bm-TSSK，運用適時熒光定量PCR檢測經(jīng)RNAi后Bm-TSSK的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果顯示，該基因在幼蟲和蛹期的抑制效果較好，分別為對照的58%和27%。對蛹抑制對象進(jìn)行雜交，調(diào)查了受精率和F1代蟻蠶的孵化率。結(jié)果顯示，F(xiàn)1代的受精率分別為97%和95%，實驗組蠶卵的孵化率與對照組比較降低，分別為68%、95%。研究結(jié)果表明，家蠶Bm-TSSK基因的表達(dá)下調(diào)，對精子的受精率無顯著影響，但影響