棉花絲裂原活化蛋白激酶基因GbMPK3的功能鑒定.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)級(jí)聯(lián)廣泛存在于各種真核生物體內(nèi)，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的過程中具有重要作用。本研究從海島棉Hai7124根系中分離到一個(gè)在受黃萎病菌侵染時(shí)上調(diào)表達(dá)的MAPK類基因GbMPK3，并分別在本氏煙和陸地棉YZ1中對(duì)其在植物抗非生物脅迫和生物脅迫中的功能和調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了分析，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.GbMPK3的克隆及序列分析
　　從海島棉Hai7124受黃萎病菌V991處理的RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中分

2、離到一條在黃萎病菌侵染時(shí)表達(dá)量明顯變化的EST序列(CL1Contig1773)，通過RACE和Genome-walking獲得該基因的全長(zhǎng)和啟動(dòng)子序列。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有MAPK的典型特征，屬于MAPK基因家族TEY亞家族A組的成員，并與擬南芥MPK3的同源度為68％，因此將其命名為GbMPK3。將GbMPK3蛋白的N端融合GFP，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示GbMPK3蛋白主要定位于細(xì)胞核。

3、　　2.GbMPK3的表達(dá)模式分析
　　利用RT-PCR和qPCR分析了GbMPK3的表達(dá)模式。結(jié)果表明GbMPK3的表達(dá)水平較低且具有組織特異性，在根系、花瓣、花藥和纖維中表達(dá)量相對(duì)較高。GbMPK3在棉花根系中的表達(dá)還受到冷、高溫、鹽、甲基紫精(MV)和脫水等非生物逆境、水楊酸(SA)等激素以及黃萎病菌侵染的誘導(dǎo)。
　　3.超量表達(dá)GbMPK3提高了煙草對(duì)干旱和氧化脅迫的耐受性
　　構(gòu)建了GbMPK3基因超量表達(dá)載

4、體并分別轉(zhuǎn)化煙草和棉花。通過抗性篩選和分子鑒定分別獲得了高量表達(dá)GbMPK3的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花株系。對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在成株期進(jìn)行干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草具有更強(qiáng)的耐旱性。表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因系復(fù)水之后的株高和存活率顯著高于野生型。生理生化分析發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GbMPK3提高了煙草在干旱脅迫下抗氧化酶APX的基因表達(dá)和酶活性，從而減少了煙草細(xì)胞內(nèi)的活性氧積累。用MV處理煙草種子和成株期煙草葉片，發(fā)現(xiàn)MV對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因系都造成了氧化脅迫，但是野

5、生型對(duì)MV更敏感。MV處理之后野生型煙草種子的萌發(fā)率和成株期葉盤的葉綠素含量均顯著低于轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR分析結(jié)果顯示，GbMPK3超表達(dá)的煙草在MV處理后抗氧化酶APX的基因表達(dá)量高于野生型。推測(cè)超量表達(dá)GbMPK3增強(qiáng)煙草對(duì)干旱和氧化脅迫的耐受性可能與提高抗氧化酶的表達(dá)和活性有關(guān)。
　　4.超量表達(dá)GbMPK3影響了煙草對(duì)煙草花葉病毒(TMV)和灰霉病菌的抗性
　　對(duì)超量表達(dá)GbMPK3基因的煙草轉(zhuǎn)基因系和野生型進(jìn)行

6、病原菌接種處理。轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV的抗性增強(qiáng)，超表達(dá)GbMPK3降低了TMV在煙草中擴(kuò)散和繁殖的速率;而接種灰霉病菌后轉(zhuǎn)基因煙草則表現(xiàn)出更感病的表型。
　　5.超量表達(dá)GbMPK3降低了煙草和棉花對(duì)黃萎病菌的抗性
　　對(duì)超量表達(dá)GbMPK3的煙草和棉花轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行黃萎病菌接種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和棉花的抗病性都顯著降低。受黃萎病菌侵染后，野生型和轉(zhuǎn)基因材料都表現(xiàn)出葉片萎蔫、黃化等黃萎病的典型病征，但野生型的葉片黃化與萎蔫出

7、現(xiàn)的時(shí)期晚于轉(zhuǎn)基因系，具體表現(xiàn)為野生型的發(fā)病率和病指顯著低于轉(zhuǎn)基因系。利用VIGS方法抑制棉花中GbMPK3的表達(dá)，對(duì)GbMPK3沉默的棉花進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。接種黃萎病菌后，對(duì)照材料和抑制GbMPK3表達(dá)的材料之間沒有觀察到抗病性的差異，兩者在葉片黃化和脫落程度上無明顯區(qū)別。說明抑制GbMPK3表達(dá)對(duì)棉花抗黃萎病的影響不大，而超量表達(dá)GbMPK3顯著減弱了植物對(duì)黃萎病菌的抗病性。
　　6.GbMPK3影響黃萎病菌侵染下棉花SA相關(guān)基因

8、的表達(dá)
　　qPCR分析顯示，無論是GbMPK3抑制表達(dá)、GbMPK3超量表達(dá)還是野生型的棉花根系中SA相關(guān)基因，如WRKY70、PR1和PR5等，在接種5天后相對(duì)于接水處理的對(duì)照組都顯著上調(diào)。與野生型相比，GbMPK3超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因系中WRKY70、PR1和PR5等基因的表達(dá)水平顯著升高;而抑制GbMPK3表達(dá)并未影響PR1和PR5的表達(dá)。這些結(jié)果說明棉花品種YZ1受黃萎病菌侵染后SA路徑被激活，GbMPK3的超量表達(dá)增強(qiáng)了SA