MiR-21介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶激酶3低調(diào)白介素-6-腫瘤壞死因子-α保護(hù)腎臟.pdf

1、第一部分 MicroRNA-21-5p靶向調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶激酶3
　　目的
　　驗(yàn)證MicroRNA-21-5p（miR-21-5p）與絲裂原活化蛋白激酶激酶3（MKK3）3’非編碼區(qū)（3’UTR）結(jié)合，證實(shí)miR-21-5p與MKK3的靶向調(diào)控關(guān)系。
　　方法
　　1、分別構(gòu)建MKK33’UTR報(bào)告載體（MKK3-3U）及MKK33’UTR突變報(bào)告載體（MKK3-3U-M）；化學(xué)合成miR-21-5p模擬

2、物（mimics）、miR-21-5p抑制劑（inhibitor）及無(wú)意義miR(NC)。
　　2、分別用NC（NC1組）、mimics（mimic1組）、inhibitor（inhibitor1組）與MKK3-3U共轉(zhuǎn)染人胚腎（HEK293）細(xì)胞，雙熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光比值。
　　3、分別用空載質(zhì)粒（pYr-MirTarge）（對(duì)照組）、MKK3-3U（Wt組）、MKK3-3U-M（Mut組）與mimics共轉(zhuǎn)染HE

3、K293，雙熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光比值。
　　4、NC（NC2組）、mimics（mimic2組）、inhibitor（inhibitor2組）分別干預(yù)人腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞；采用反轉(zhuǎn)錄PCR、Western blot方法檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞中MKK3的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1、NC1組、mimic1組、inhibitor1組熒光比值分別為100％、67.99%、133.17%。mimic1

4、組與NC1組比較，差異有顯著性（P<0.01）。證實(shí)了miR-21-5p能與MKK33’UTR靶向結(jié)合。
　　2、對(duì)照組、Wt組、Mut組熒光比值分別為100%、65.3%、98.48%，Wt組與對(duì)照組比較，差異有顯著性（P<0.01），而Mut組、對(duì)照組間熒光比值差異無(wú)顯著性（P>0.05）。證實(shí)了miR-21-5p不能與突變的MKK33’UTR結(jié)合。
　　3、NC2組、mimic2組、inhibitor2組，MKK3 m

5、RNA相對(duì)表達(dá)量為1.36±0.02、1.01±0.04、1.43±0.06（P<0.01）；蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為0.97±0.05,0.62±0.06、1.36±0.32（P<0.01）；mimic2組、NC2組間MKK3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05）。證實(shí)miR-21-5p在mRNA及蛋白水平低調(diào)MKK3。
　　結(jié)論
　　MKK3是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p在mRNA和蛋白質(zhì)水平調(diào)

6、控MKK3表達(dá)，提示miR-21-5p可能是調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號(hào)通路的重要分子。
　　第二部分缺血再灌注腎損傷模型小鼠腎臟miR-21/絲裂原活化蛋白激酶激酶3/白介素-6及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及意義
　　目的
　　探討缺血再灌注腎損傷模型小鼠腎臟miR-21、MKK3及下游白介素-6（IL-6）/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)及意義。
　　方法
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：將

7、雄性57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3大組：對(duì)照組（C組）、假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組），除C組外，其余兩組根據(jù)再灌注時(shí)間點(diǎn)分別分為9個(gè)亞組，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；
　　2、動(dòng)物模型：采用夾閉雙側(cè)腎蒂30min后再灌注的方法，建立缺血再灌注腎損傷模型；假手術(shù)組只暴露雙側(cè)腎蒂，不進(jìn)行夾閉。
　　3、實(shí)驗(yàn)方法：全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)各組小鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水

8、平；HE染色觀察腎臟病理?yè)p害，腎小管間質(zhì)病理?yè)p害評(píng)分法計(jì)量小鼠腎臟病理?yè)p害程度；實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)腎組織miR-21表達(dá)水平；RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)腎組織MKK3、IL-6、TNF-α表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1、腎功能變化及腎臟病理評(píng)分：IR組缺血再灌注后Scr、BUN、腎臟病理?yè)p害及腎小管間質(zhì)病理評(píng)分逐漸加重，24h達(dá)到最高峰，之后逐漸下降，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組差異具有顯著性（P<0.01）。
　　2

9、、腎臟miR-21的表達(dá)變化：IR組再灌注后腎臟miR-21表達(dá)水平逐漸上升，12h至24h上升最快，24h達(dá)峰值，為基線(xiàn)值的286.0倍，并穩(wěn)定維持在此高水平。
　　3、MKK3表達(dá)變化：IR組小鼠腎組織MKK3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在再灌注后逐漸上升，24h達(dá)到最高值，之后逐漸下降。
　　4、腎臟IL-6、TNF-α表達(dá)變化：IR組小鼠腎臟IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在缺血再灌注后急劇上升，再灌注6h達(dá)到高峰，

10、然后逐漸下降。IR組小鼠腎臟缺血再灌注后TNF-α mRNA表達(dá)水平逐漸上升，于再灌注后24h達(dá)峰值；與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)不同的是：IR組缺血再灌注后TNF-α蛋白表達(dá)逐漸上升，再灌注48h達(dá)到高峰，48h至72h保持高值，之后逐漸下降。
　　結(jié)論
　　MiR-21及絲裂原活化蛋白通路及下游炎癥因子—白介素-6/腫瘤壞死因子-α與缺血再灌注腎損傷密切相關(guān)，miR-21及MKK3及下游因子—IL-6/TNF-α在缺血再灌注腎臟

11、損傷過(guò)程中起著重要作用。
　　第三部分腎臟缺血預(yù)處理上調(diào)miR-21低調(diào)絲裂原活化蛋白激酶激酶3及下游白介素-6/腫瘤壞死因子-α保護(hù)腎臟
　　目的
　　探討miR-21介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶激酶3低調(diào)白介素6/腫瘤壞死因子-α對(duì)腎臟的保護(hù)作用。
　　方法
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：將雄性 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3大組：缺血再灌注組（IR組）、缺血預(yù)處理再灌注組（IPC+IR組）、假缺血預(yù)處理再灌注組（S+I

12、R組），各組根據(jù)再灌注時(shí)間點(diǎn)分別分為9個(gè)亞組，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；
　　2、動(dòng)物模型：
　　（1）缺血再灌注腎損傷模型：采用夾閉雙側(cè)腎蒂30min后再灌注方法，建立缺血再灌注腎損傷模型；
　?。?）缺血預(yù)處理模型：首先行雙側(cè)腎蒂夾閉15min鐘再灌注，4d后采取夾閉雙側(cè)腎蒂30min后再灌注建立模型；
　?。?）假缺血預(yù)處理模型：首先行游離雙側(cè)腎蒂但不夾閉，4d

13、后采取夾閉雙側(cè)腎蒂30min后再灌注建立模型；
　　3、實(shí)驗(yàn)方法：全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；HE染色觀察腎臟病理?yè)p害情況，腎小管間質(zhì)病理評(píng)分計(jì)量腎臟病理?yè)p害程度；實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)腎組織miR-21表達(dá)水平；RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)腎組織MKK3、IL-6、TNF-α表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1、腎功能的變化及腎臟病理評(píng)分：
　?。?）腎功能：IR組再灌注后Scr

14、、BUN逐漸加重，于24h達(dá)最高峰，之后逐漸下降；IPC+IR組再灌注后Scr、BUN、腎臟病理?yè)p傷的變化趨勢(shì)與IR組一致，但損傷程度較IR組明顯減輕；
　?。?）腎臟病理評(píng)分：IR組、IPC+IR組0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的腎小管間質(zhì)病理評(píng)分（分）分別為：1.00±0.12 v0.30±0.11、1.50±0.15v1.50±0.15、2.00±0.15 v1.30±0.16、2.60±0.2

15、3 v1.5±0.16、3.80±0.22 v1.70±0.12、3.10±0.24 v1.30±0.13、2.50±0.12 v1.30±0.11、2.30±0.24 v1.00±0.11、1.60±0.11 v0.50±0.07，在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間的腎小管間質(zhì)病理?yè)p害評(píng)分均有顯著差異（P<0.01）。
　　2、腎臟miR-21的表達(dá)變化：IR組再灌注24h，腎臟miR-21達(dá)峰值，為基線(xiàn)值的286.0倍，之后維持高值；而IP

16、C+IR組再灌注0h，腎臟miR-21即達(dá)峰值，為基線(xiàn)值的286.0倍，并一直維持在此高峰值。
　　3、MKK3的表達(dá)變化：IR組MKK3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在再灌注后逐漸上升，24h達(dá)到最高值，之后逐漸下降；IPC+IR組 MKK3 mRNA和蛋白質(zhì)的變化趨勢(shì)與IR組一致，但表達(dá)水平明顯低于IR組。IR組、IPC+IR組0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的MKK3 mRNA的水平分別為：0.89±0.

17、10 v0.51±0.06；1.45±0.13 v0.52±0.07；1.65±0.18 v0.54±0.09；2.15±0.22 v0.61±0.11；3.19±0.31 v0.81±0.09；2.66±0.28 v0.76±0.10；1.87±0.22 v0.68±0.08；1.68±0.15 v0.66±0.07；1.62±0.17 v0.63±0.08；MKK3蛋白質(zhì)的水平(OD/10000）分別為：15.51±1.56 v14

18、.36±1.51；34.24±2.82 v21.14±1.67；71.54±5.43 v31.52±2.01；145.16±8.29 v45.39±2.03；159.50±7.32 v60.34±3.67；209.74±8.13 v95.12±4.02；95.58±5.47 v62.13±2.31；87.32±5.12 v42.51±2.57；45.13±3.25 v33.18±1.99。IR組與IPC+IR組相比較，兩組在再灌注3h~

19、7d各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)亞組MKK3 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)差異均具有顯著性（P<0.05）。
　　4、IL-6和TNF-α表達(dá)變化：
　?。?）IR組IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在缺血再灌注后急劇上升，再灌注6h達(dá)到高峰，然后逐漸下降，而IPC+IR組IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)一直保持較低水平表達(dá)。IR組、IPC+IR組0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的IL-6 mRNA水平分別為：0.65±0.11

20、 v0.30±0.07；1.53±0.14 v0.39±0.05；2.82±0.24 v0.43±0.07；2.21±0.26 v0.41±0.09；1.73±0.21 v0.44±0.09；1.55±0.18 v0.46±0.07；1.38±0.14 v0.43±0.06；1.16±0.08 v0.41±0.06；0.89±0.06 v0.40±0.05；IL-6蛋白質(zhì)的水平(OD/10000）分別為：45.22±1.58 v35.1

21、6±2.53；68.13±2.72 v42.73±1.99；135.28±8.42 v58.33±2.23；108.99±5.49 v50.11±2.41；91.18±6.32 v47.29±4.12；72.63±5.15 v46.63±3.87；66.57±4.47 v43.18±2.67；58.74±5.82 v40.12±2.85；46.33±2.27 v36.47±1.82。IR組與IPC+IR組相比較，兩組在再灌注3h~5d各

22、個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)亞組IL-6 mRNA表達(dá)差異均具有顯著性（P<0.05）；IL-6蛋白質(zhì)表達(dá)在0h~7d各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)亞組差異均具有顯著性（P<0.01）。
　?。?）IR組缺血再灌注后TNF-α mRNA表達(dá)逐漸上升，于再灌注后24h達(dá)峰值，之后逐漸下降；缺血預(yù)處理后，小鼠腎臟TNF-αmRNA的變化趨勢(shì)與IR組一致，但其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平一直較IR組低；與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)不同的是：IR組缺血再灌注后TNF-α蛋白表達(dá)逐漸上升

23、，再灌注后48h達(dá)到高值，48h至72h保持高值，之后逐漸下降；缺血預(yù)處理后，小鼠腎臟TNF-α蛋白質(zhì)的變化趨勢(shì)與IR組一致，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平一直較IR組低。IR組、IPC+IR組0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的TNF-αmRNA水平分別為：0.80±0.20 v0.50±0.07；1.66±0.21 v0.51±0.11；2.02±0.26 v0.50±0.09；2.63±0.31 v0.54±0

24、.09；3.57±0.42 v0.54±0.12；2.82±0.47 v0.55±0.15；2.19±0.32 v0.52±0.16；1.73±0.22 v0.52±0.14；1.12±0.17 v0.50±0.09；TNF-α蛋白質(zhì)的水平(OD/10000）分別為：63.67±3.56 v62.31±4.22；82.36±5.82 v66.47±4.41；97.23±6.43 v70.39±4.57；106.67±6.29 v77.1

25、2±4.63；124.37±7.32 v81.36±4.74；167.53±7.23 v91.16±5.01；158.36±5.43 v81.82±4.45；98.42±5.22 v70.11±4.87；82.31±3.17v65.35±4.39。IR組與IPC+IR組相比較，兩組在再灌注3h~5d各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)亞組 TNF-α mRNA表達(dá)差異均具有顯著性（P<0.05）；TNF-α蛋白質(zhì)表達(dá)在0h~7d各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)亞組差異均具有顯