p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)調(diào)節(jié)P19誘導(dǎo)分化的多功能細(xì)胞的起搏離子通道.pdf

1、目的:在哺乳動物胚胎分化過程中，心血管系統(tǒng)形態(tài)形成開始于人類妊娠期的第20天和老鼠妊娠期第7.5天，并伴隨單管狀心臟的形成和自發(fā)性搏動的產(chǎn)生。心臟特定的基因表達(dá)所觸發(fā)特定收縮蛋白和心臟分化早期離子通道蛋白的產(chǎn)生。最近，已經(jīng)證明心臟基因的表達(dá)受胚胎心臟分化中幾種特定的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)。Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C被認(rèn)為是心臟形成早期起著關(guān)鍵性作用的心臟特定轉(zhuǎn)錄因子，同時也是心臟感應(yīng)信號區(qū)別于其他組織或胚層有效的分子標(biāo)記。

2、r>　　 同源框基因Csx/Nkx2.5脊椎動物同系的果蠅，是中胚層引起心肌層已知最早的標(biāo)記之一，并且在整個心肌在心臟完全形成過程中持續(xù)性表達(dá)。GATA4是心臟特定GATA4家族的成員中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能早期識別心臟基因區(qū)域并隨之在心臟形成中持續(xù)表達(dá)。MEF2C屬于MADS-box基因中MEF2家族，在老鼠整個胚胎形成中表達(dá)，調(diào)控心臟形態(tài)的形成和心肌產(chǎn)生。細(xì)胞增殖因子的刺激下，包括BMP，ET-1和CT-1，心肌細(xì)胞分化產(chǎn)生是由細(xì)胞核

3、內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活化產(chǎn)生，例如Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C。然而，在胚胎形成的早期階段，信號傳導(dǎo)系統(tǒng)從細(xì)胞膜受體信號到核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，然后激活心臟特定蛋白包括離子通道表達(dá)，這一點(diǎn)鮮為人知。換句話說，MAPK通路，ERK1/2，ERK5，JNK和p38家族，是細(xì)胞外信號傳入細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的主要的信號系統(tǒng)。眾所周知，MAPK在心肌細(xì)胞分化和心臟形態(tài)形成過程中起著關(guān)鍵性作用。
　　 盡管目前已知心臟基因分化早期的幾種轉(zhuǎn)錄因子，

4、但是對負(fù)責(zé)細(xì)胞自律性的上游信號調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子很大程度上還是未知的。本研究目的在于闡明心臟基因分化的早期階段，轉(zhuǎn)錄因子在P19誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞對心臟起搏離子通道表達(dá)的作用，并且證明這些轉(zhuǎn)錄因子是通過有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)信號通路調(diào)節(jié)。
　　 方法:本研究通過使用二甲基亞砜(Me2SO)將P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞和負(fù)責(zé)起搏電位的3種細(xì)胞膜離子通道電流，L-型鈣離子通道電流(ICa.L)，T-型鈣離子通道電流(ICa.T

5、)，和超極化激活內(nèi)向離子通道電流(If)，并通過RT-PCR，蛋白印跡(Westernblot)，和Patch-clamp方法進(jìn)行測定。三種MAPK總家族，p38，JNK和ERK1/2，5，使用PD98059，SP600125和SB203580抑制劑檢測它們對離子通道的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)果:在P19誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞的心臟基因分化早期階段，三種轉(zhuǎn)錄因子，Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C，被認(rèn)為是心臟發(fā)育的最初標(biāo)記，

6、早在自發(fā)性搏動的第10天之前，細(xì)胞分化的第7天已全部高度表達(dá)。p38MAPK抑制劑SB203580存在時，P19誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的自發(fā)性搏動和三種起搏離子通道的表達(dá)被抑制。p38MAPK以不同的方式直接抑制轉(zhuǎn)錄因子Csx/Nkx2.5和GATA4，而并不是MEF2C;除了磷酸化的GATA4，其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均被p38MAPK抑制而減少。換句話說，在ERK1/2，5抑制劑PD98059或JNKMAPK抑制劑SP600125存在時，P19細(xì)