ADMA對內皮生長暈細胞凋亡及其相關p38絲裂素活化蛋白激酶表達的影響.pdf

1、目的:探討非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)對內皮生長暈細胞(EOCs)凋亡和粘附能力的影響以及凋亡相關p38絲裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)表達水平的變化。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離臍血中的單個核細胞,接種至預先用人纖維連接蛋白包被2h的6孔培養(yǎng)板,采用己添加多種特定生長因子的含10％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液誘導分化培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后用Hanks液輕柔洗去未貼壁細胞,貼壁細胞加上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后一周內每

2、24 h更換一半培養(yǎng)液,一周后每72 h換全液并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。待鋪路石樣細胞生長匯合后傳代,擴增后取第二代細胞采用免疫組化法鑒定細胞表達CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關抗原的情況,通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞的DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色結果以鑒定所培養(yǎng)細胞的內皮屬性。
　　 取第二代EOCs按1×105個/孔密度接種至6孔板中并分為五組:(1)對照組:使用配制ADMA的溶劑(含

3、1％PBS的EGM-2培養(yǎng)基)與細胞共同孵育48h；(2)ADMA各濃度干預組:分別用含1、5、10、30μmol/L ADMA的EGM-2培養(yǎng)基與細胞共同孵育48h。
　　 將上述五組細胞分別采用AnnexinV-FITC/PI雙染色法行流式細胞儀檢測細胞凋亡率；DAPI染色和AnnexinV-FITC/PI雙染色法在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)的改變；在倒置顯微鏡下觀察計數(shù)各組重粘附細胞數(shù)檢測細胞粘附能力；取對照組

4、以及ADMA5、10、30μmol/L處理組用特異性的Phospho-p38MAPK、total p38 MAPK抗體的蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測p38 MAPK的活性。
　　 結果:臍血中分離獲得的單個核細胞在誘導培養(yǎng)第4～6天開始出現(xiàn)梭形細胞,第6～8天左右形成若干個小的細胞集落,細胞形態(tài)變?yōu)榈湫偷涅Z卵石形,細胞由中心到外周延展呈橢圓形鋪路石樣排列,同時細胞增殖進入高峰期。在15～20d左右各個集落相互融

5、合,布滿整個六孔板底部。
　　 免疫組化染色顯示所培養(yǎng)細胞的CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關抗原表達陽性率均為100％。
　　 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞雙染色結果表明,所培養(yǎng)的細胞具有成熟內皮細胞的特性,能吞噬ac-LDL并結合UEA-I。當細胞吞噬DiI-ac-LDL時在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光,細胞結合FITC-LYEA-Ilectin在藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。
　　 以上觀察鑒定結果表明,從臍靜脈血分離獲

6、取的單個核細胞經(jīng)含特定生長因子的EGM-2培養(yǎng)基誘導分化培養(yǎng)并傳代后,細胞基本上為純的EOCs。
　　 AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡率表明,與對照組相比,1～30μmol/L ADMA可呈濃度依賴性的誘導EOCs的凋亡(P<0.01)。
　　 通過DAPI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,ADMA處理組可出現(xiàn)部分染色質濃縮、細胞核呈碎塊狀濃染等細胞凋亡形態(tài)學改變；通過An

7、nexinV/PI雙染色法在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,ADMA處理組亦可見到更顯著的細胞膜完整性缺失等凋亡改變。
　　 在細胞粘附能力方面,與對照組相比,1μmol/L ADMA對EOCs的粘附能力無明顯影響(18.70±4.93 vs19.75±6.00,P>0.05),5～30μmol/LADMA顯著抑制EOCs的粘附能力(P<0.05)。
　　 通過Western blot對不同濃度ADMA

8、作用于EOCs48h后細胞的p38 MAPK活性進行檢測表明,在5～30μmol/L濃度范圍內,隨著ADMA濃度增加,Phospho-p38MAPK蛋白表達增加,而總p38 MAPK蛋白表達無明顯改變,Phospho-p38/p38MAPK灰度比值隨ADMA濃度增大而增大,各處理組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 結論:經(jīng)密度梯度離心法獲得臍血單個核細胞,用含特定生長因子的EGM-2培養(yǎng)基誘導分化、貼壁培養(yǎng)可

9、以在體外成功獲得人臍血EOCs。通過免疫組化染色及熒光細胞化學染色可以證實所培養(yǎng)的細胞符合EOCs的表面抗原標志表達情況以及內皮特性。
　　 1～30μmol/L ADMA呈濃度依賴性地誘導EOCs凋亡。5～30μmol/L ADMA可抑制EOCs粘附能力,而1μmol/L ADMA對其粘附能力無明顯影響。
　　 ADMA對EOCs的凋亡誘導作用可能與p38 MAPK磷酸化水平上升有關,即ADMA通過激活p38 MAPK