新生大鼠急性高氧肺損傷時(shí)P38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化和MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)的研究.pdf

1、目的:1.建立新生大鼠高氧性肺損傷的模型；
　　 2.觀察高氧性肺損傷急性期肺組織中P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)的磷酸化與基質(zhì)金屬蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinases,MMP-2,9)及其特異性組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRN

2、A的表達(dá)水平的變化；
　　 3.探討P38-MAPK的磷酸化對高氧肺損傷急性期炎癥反應(yīng)及MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型的建立:72只3～5天的新生Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分成3組:Ⅰ空氣組；Ⅱ高氧+生理鹽水(高氧組)；Ⅲ高氧+SB203580(干預(yù)組),各24只。再按實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)3,7天分二個(gè)亞組12只；每個(gè)亞組分灌洗組

3、和非灌洗組,各6只。將Ⅱ、Ⅲ組放于氧箱中,保持箱內(nèi)氧氣濃度為90％～95％,Ⅰ組置于空氣中；Ⅲ組每日同一時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射SB203580(P38-MAPK特異性磷酸化抑制劑,美國Sigma公司,0.5 mg/kg)；Ⅱ組尾靜脈注射等量的生理鹽水。
　　 2.標(biāo)本采集:每組分為①肺泡灌洗組和②非肺泡灌洗組兩個(gè)亞組。
　　 灌洗組在各時(shí)間點(diǎn)分別麻醉動(dòng)物后以生理鹽水行支氣管肺泡灌洗,留取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalve

4、olar lavage fluids,BALF)測定BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)；
　　 非灌洗組各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,取部分右肺制作肺組織勻漿,檢測磷酸化P38MAPK,MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA,肺組織勻漿總蛋白；余下右肺組織稱量后置于烤箱中測肺濕/干重比。左肺固定、包埋、切片,用于常規(guī)HE染色,觀察肺組織病理學(xué)變化,拍照存檔；
　　 3.肺組織磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)檢測(Weste

5、rn blot法):采用改良RIPA緩沖液常規(guī)提取肺組織中蛋白質(zhì),BCA比色法(Bio-Rad蛋白定量檢測試劑盒)測定所提取蛋白的濃度。各組蛋白取樣100μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以封閉緩沖液室溫封閉1 h,phospho-P38 MAPK一抗(1:1000,購自美國SANTACRUZ公司)4℃孵育過夜,二抗(1:2000)孵育1 h,ECL顯色。用Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析處理,蛋白含量用

6、目的條帶校正容積(Adj volume)/GAPDH校正容積(Adj volume)表示。
　　 4.肺組織MMP.2、MM P-9、TIMP-1 mRNA檢測(RT-PCR法)。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般狀況:空氣組大鼠精神狀態(tài)佳、活動(dòng)靈活,實(shí)驗(yàn)期間體重增長穩(wěn)定；高氧組大鼠3天后精神反應(yīng)差,7天后體重增長不明顯,呼吸急促,活動(dòng)遲緩；SB203580干預(yù)組大鼠精神狀態(tài)稍差、活動(dòng)稍減少、體重增長不明顯,呼吸稍急

7、促。
　　 2.肺組織病理切片:高氧組3天時(shí)肺泡腔內(nèi)有明顯出血和炎性細(xì)胞滲出,7天時(shí)損傷加重,肺間隔增寬,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。SB203580干預(yù)組與高氧組比較炎癥改變減輕,肺間隔增寬不明顯。
　　 3.肺濕/干重比(W/D):實(shí)驗(yàn)3天,高氧組較空氣組增高(5.5104±0.5001 vs4.2706±0.3884,p<0.01)；實(shí)驗(yàn)7天,該比值進(jìn)一步升高(5.7671±0.3599 vs4.3977±0.2313,p<0

8、.01)。SB203580干預(yù)組與高氧組比較,相同時(shí)間點(diǎn)該比值明顯降低(實(shí)驗(yàn)3天,4.7411±0.3112 vs5.5104±0.5001,p<0.05；實(shí)驗(yàn)7天,4.6761±0.2504 vs5.7671±0.3599,p<0.01)。
　　 4.肺組織勻漿總蛋白(Total Protein,TP)含量檢測:實(shí)驗(yàn)3天,高氧組TP含量已高于空氣組(1.0463±0.2113 vs0.7323±0.0297,p<0.05)；7

9、天時(shí),高氧組TP含量持續(xù)增高(1.2226±0.1751 vs0.9416±0.1365,p<0.05)；SB203580干預(yù)組與高氧組比較,實(shí)驗(yàn)3天時(shí)TP含量無顯著差異(1.0262±0.1281 vs1.0463±0.2113,p>0.05),7天時(shí)明顯下降(0.92974±0.0642 vs1.22264±0.1751,p<0.05)。
　　 5.BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù):實(shí)驗(yàn)3天,高氧組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于空氣對照組

10、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(42.32±4.78 vs11.73±3.86,p<0.01)；實(shí)驗(yàn)7天,白細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)一步增加(126.48±18.88 vs18.754±3.74,p<0.01)。SB203580干預(yù)組與高氧組比較,相同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降(實(shí)驗(yàn)3天,21.35±3.21 vs42.32±4.78,p<0.01；實(shí)驗(yàn)7天,33.75±8.63 vs126.48±18.88,p<0.01)。
　　 6.肺組織磷酸化P38

11、 MAPK(p-P38 MAPK)表達(dá):空氣組肺組織p-P38 MAPK僅有較弱的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)3天,高氧組p-P38 MAPK表達(dá)明顯增強(qiáng),與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空氣組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.5064±0.160 vs0.627±0.024,p<0.01)；實(shí)驗(yàn)7天,P-P38 MAPK表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(1.998±0.176 vs0.664_±0.034,p<0.01)。SB203580干預(yù)組與高氧組比較,相同時(shí)間點(diǎn)p-P38 MAPK表達(dá)明顯

12、減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(實(shí)驗(yàn)3天,0.9364±0.051 vs1.506+0.160,p<0.01；實(shí)驗(yàn)7天,1.319±0.082 vs1.9984±0.176,p<0.01)。
　　 7.肺組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達(dá):空氣組MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平低。高氧組MMP-2(實(shí)驗(yàn)3天,3.4284±0.316 vs1.681±0.092,升高103％,p<0.01；實(shí)驗(yàn)

13、7天,1.149±0.129 vs0.490±0.034,升高134％,p<0.01)、MMP-9(實(shí)驗(yàn)3天,0.383±0.011 vs0.133±0.006,升高190％,p<0.01；實(shí)驗(yàn)7天0.329±0.008 vs0.142±0.008,升高132％,p<0.01)、TIMP-1 mRNA(實(shí)驗(yàn)3天,0.294±0.015 vs0.112±0.010,升高54％,p<0.05；實(shí)驗(yàn)7天,0.449±0.009 vs0.155

14、±0.006,升高40％,p<0.05)表達(dá)明顯增強(qiáng),與相同時(shí)間點(diǎn)空氣組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且MMP-2、MMP-9 mRNA升高幅度較TIMP-1 mRNA升高幅度大；SB203580干預(yù)組與高氧組比較,相同時(shí)間點(diǎn)MMP-2(實(shí)驗(yàn)3天,2.104±0.094vs3.428±0.316,降低39％,p<0.01；實(shí)驗(yàn)7天0.620±0.027vs1.149±0.129,降低46％,p<0.01)、MMP-9(實(shí)驗(yàn)3天,0.208±0

15、.012vs0.383±0.011,降低46％,p<0.01；實(shí)驗(yàn)7天,0.198±0.0112 vs0.329±0.008,降低57％,p<0.01)、TIMP-1(實(shí)驗(yàn)3天,0.197±0.013 vs0.294±0.015,降低18％,p<0.05；實(shí)驗(yàn)7天,0.273±0.018 vs0.449±0.009,降低14％,p<0.05)mRNA表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且MMP-2、MMP-9 mRNA降低幅度較TIMP-1 m

16、RNA降低幅度大。
　　 結(jié)論:
　　 1.長期的高濃度吸氧可導(dǎo)致新生大鼠的急性肺損傷,病理表現(xiàn)為肺組織局部充血和出血、炎癥滲出、肺間隔斷裂、肺泡腔擴(kuò)大和肺結(jié)構(gòu)組織紊亂；
　　 2.p-P38 MAPK在新生大鼠急性高氧性肺損傷的肺組織中表達(dá)水平明顯升高,且隨肺損傷程度的加重而進(jìn)一步升高,提示P38 MAPK信號傳導(dǎo)通路的激活可能參與了高氧肺損傷發(fā)病過程中的調(diào)控；
　　 3.高氧肺損傷時(shí)肺組織中MMP-2

17、、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào),并且MMP-2、MMP-9/TIMP-1的平衡被改變,表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的過度表達(dá)及與基質(zhì)金屬蛋白酶特異性組織抑制劑(TIMPs)表達(dá)之間的失衡在高氧肺損傷的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要的作用；
　　 4.P38 MAPK特異性磷酸化抑制劑SB203580通過抑制P38 MAPK的磷酸化,可減輕高氧肺損傷急性期的炎癥反應(yīng),同時(shí)影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRN