家蠶translin蛋白的初步研究.pdf

1、Translin又名轉位蛋白,是一種可以與DNA/RNA相結合,分子量大約27 kD,進化保守的蛋白。在細胞內參與染色體重組、修復及細胞分裂等多種生物學活動。在它的三級結構中有一段保守的亮氨酸拉鏈區(qū),對于形成多聚體是必須的。Translin蛋白與mRNA的3'端非編碼序列相結合,進而調節(jié)mRNA的轉運和翻譯。Translin蛋白還參與端粒長度調節(jié),與一些腫瘤發(fā)病有關。
　　 從本實驗室構建的家蠶cDNA文庫中克隆到一條ORF長度

2、為708bp的家蠶translin基因。經NCBI中BLAST比對將其命名為BmTLP(for translin-like proteinfrom.Bombyx mori),該基因編碼235個氨基酸殘基,預測分子量為27.259 kD,等電點為5.87。本實驗通過設計PCR引物,克隆目的基因。其中BamHⅠ和XhoⅠ是該基因克隆時的兩個酶切位點。將雙酶切的PCR產物融合到表達質粒pET-28a(+)相應的酶切位點上,成功構建重組質粒pE

3、T-28a(+)-BmTLP。再將重組質粒轉入BL21(DE3)并誘導表達,表達的重組蛋白以可溶形式存在,經過鎳柱親和層析純化后,經FPLC反相柱層析進一步純化,再進行質譜分析證實該蛋白表達的正確性。以純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得該蛋白的多克隆抗體,經ELISA檢測,抗體效價可達1:25600以上。為了解該蛋白在家蠶中各時期及各組織中的分布,做了Western blotting和熒光定量PCR相關實驗,結果顯示五齡幼蟲的各組