家蠶30kD載脂蛋白19G1的表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、30K蛋白家族是一類(lèi)在氨基酸組成及免疫學(xué)活性上相似的蛋白,分子量約為30 kD。家蠶30K蛋白是由脂肪體合成的非雌特異性脂蛋白,表達(dá)受保幼激素的調(diào)節(jié),是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中主要儲(chǔ)藏蛋白之一,是五齡幼蟲(chóng)及蛹主要的蛋白組分,主要分布在血淋巴中。對(duì)雌性家蠶,30K蛋白還是卵黃原蛋白的重要組成部分。30K蛋白中研究比較多的是30 kD載脂蛋白6G1和19G1。Kim EJ與Park HJ別把家蠶30Kc6基因構(gòu)建入表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)得到重組蛋白

2、,純化后添加到哺乳動(dòng)物及昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基中,能抑制哺乳動(dòng)物及昆蟲(chóng)細(xì)胞的凋亡;KooTY[5]等構(gòu)建了表達(dá)重組30Kc6基因的生產(chǎn)干擾素的CHO細(xì)胞系,結(jié)果表明30Kc6基因的表達(dá)抑制細(xì)胞的凋亡并提高干擾素的產(chǎn)量。
　　 本研究從家蠶蛹cDNA文庫(kù)中通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一條低分子量30 kD載脂蛋白19G1前體(low molecular mass30 kD lipoprotein19G1 precursor)的EST序列(Gen

3、Bank登錄號(hào):AY568957)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該基因ORF不含內(nèi)含子,由長(zhǎng)為771 bp的單一外顯子編碼256個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)分子量約為29.5 kD,等點(diǎn)電為7.290。我們將其ORF克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,雙酶切鑒定及序列測(cè)定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化后獲得高純度的目的蛋白,以該重組蛋白作為抗原免疫新西

4、蘭大白兔制備多克隆抗體,經(jīng)ELISA檢測(cè),抗體效價(jià)可達(dá)1:12800,Western blotting結(jié)果顯示抗體的特異性較好。
　　 提取家蠶各個(gè)時(shí)期和五齡幼蟲(chóng)各組織的總RNA分別進(jìn)行熒光定量PCR分析結(jié)果表明,家蠶發(fā)育時(shí)期在蛹期轉(zhuǎn)錄水平最高,卵中最低;五齡幼蟲(chóng)時(shí)期在脂肪體中轉(zhuǎn)錄水平較高,絲腺和腸較低。提取家蠶各發(fā)育時(shí)期以及家蠶五齡幼蟲(chóng)各組織蛋白進(jìn)行Western blotting分析,結(jié)果表明,該蛋白在家蠶蛹中及五齡幼蟲(chóng)的脂