雌激素對載脂蛋白AⅠ體外表達作用的研究.pdf

1、目的：觀察雌激素對載脂蛋白AⅠ（Apo AⅠ）基因轉(zhuǎn)錄的影響；探討Apo AⅠ基因啟動子不同區(qū)域及ApoCⅢ/AⅣ基因調(diào)控元件在Apo AⅠ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，分析雌激素刺激對apoAⅠ基因表達的調(diào)節(jié)機制。 方法： 1.分別將0.01、0.1、1、10、20μmol/L雌激素與體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞共同孵育24h；選用10μmol/L的雌激素與HepG2細(xì)胞共同孵育0 h、1h、6h、24h、48h；分別提取總RNA

2、，采用半定量RT-PCR方法測定.Apo AⅠ mRNA表達水平，觀察不同劑量雌激素和不同刺激時間對Apo AⅠ mRNA表達的影響。 2.以攜帶螢火蟲熒光素酶報告基因的質(zhì)粒pGL2為載體，構(gòu)建攜帶ApoAⅠ基因啟動子不同長度片段的重組質(zhì)粒pGL2/-41AⅠ、pGL2/-256AⅠ和pGL2/-2500AⅠ，以及同時攜帶ApoCⅢ/AⅣ基因的重組質(zhì)粒：pGL2/-41 AⅠ CⅢAⅣ、pGL2/-256AⅠ CⅢAⅣ、pGL2

3、/-2500AⅠ CⅢAⅣ；采用陽離子脂質(zhì)體法分別將重組質(zhì)粒與攜帶海腎熒光素酶報告基因的pRL-null質(zhì)粒內(nèi)參進行雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，并在HepG2細(xì)胞中表達；轉(zhuǎn)染24小時后給予10μmol/L雌激素刺激，48小時后收集、裂解細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶報告基因的熒光強度。 結(jié)果： 1.在體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，隨雌激素濃度的增加，Apo AⅠ mRNA表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，以非生理劑量10μmol/

4、L時Apo AⅠ mRNA表達最高，與空白對照組及生理劑量濃度組（0.01、0.1、1μmol/L）相比有明顯差異（P<0.05），20μmol/L時Apo AⅠ mRNA表達降低，低于10μmol/L時，但仍高于空白對照及生理劑量組。 2.隨加入雌激素刺激時間的延長，HepG2細(xì)胞中.Apo AⅠ mRNA表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，雌激素刺激6h后 ApoAⅠ mRNA表達水平增加，與0 h、1h表達水平相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義

5、（P<0.05）；刺激24h后Apo AⅠ mRNA表達水平最高（P<0.05），48h后Apo AⅠ mRNA表達水平下降，與24h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.包含ApoAⅠ基因啟動子-256bp～+397bp和-2500bp～+397bp片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后表達的熒光素酶的相對活性明顯高于只含有-41bp～+397bp片斷的重組質(zhì)粒；同時攜帶ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重組質(zhì)粒亦顯示相似的結(jié)果。 4.同時

6、攜帶ApoCⅢ/AⅣ基因和ApoAⅠ基因啟動子不同長度片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后表達的熒光素酶的相對活性明顯高于只連接Apo AⅠ不同啟動子區(qū)域的重組質(zhì)粒pGL2/AⅠ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 5.重組質(zhì)粒pGL2/-256AⅠ及pGL2/-2500AⅠ及pGL2/-256AⅠ CⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠ CⅢAⅣ轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞其表達的熒光素酶的相對活性雌激素組明顯高于對照組（P<0.05），而

7、pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠ CⅢAⅣ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達的熒光素酶相對活性在雌激素刺激前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1.隨雌激素濃度的增加，體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中Apo AⅠ mRNA表達呈現(xiàn)升高趨勢，以濃度為10μmol/L時表達水平最高；以該濃度刺激6h后表達水平開始增加，24h達高峰，本研究顯示雌激素可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Apo AⅠ基因表達，并呈現(xiàn)部分的劑量和時間依賴性。 2.A

8、po AⅠ基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-256bp區(qū)域至上游-41bp區(qū)域，具有較強啟動子轉(zhuǎn)錄活性，可能與該區(qū)域內(nèi)含有肝特異性增強子有關(guān)。含有-2500bp～+397bp片段與-256bp～+397bp片段相比，熒光強度雖有增強，但無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示Apo AⅠ基因啟動子-256bp上游區(qū)域可能缺乏調(diào)控的順式作用元件。同時攜帶ApoCⅢ/AⅣ基因的重組質(zhì)粒的熒光強度明顯高于只含有Apo AⅠ基因片段的重組質(zhì)粒，表明Apo CⅢ/AⅣ基因調(diào)控區(qū)內(nèi)存