葡糖對(duì)載脂蛋白M代謝的影響和機(jī)制研究.pdf

1、載脂蛋白M(apoM)是1999年由瑞典隆德大學(xué)的Xu和Dahlback首先發(fā)現(xiàn)和分離的一種新型人類載脂蛋白，主要存在于血漿高密度脂蛋白HDL中。ApoM通過影響前β-HDL的形成調(diào)節(jié)膽固醇的出胞，是HDL代謝的重要調(diào)節(jié)因子，可能具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。ApoM的表達(dá)和分泌受多種因子的調(diào)節(jié)，與冠心病、糖尿病以及其他脂質(zhì)代謝紊亂的疾病關(guān)系密切。糖尿病人患者血漿apoM水平明顯下降。漢族人群中apoM基因近端啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性T-7

2、78C與血漿膽固醇和空腹血糖相關(guān)，并可能增加罹患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病小鼠肝臟和血清apoM均顯著下降，外源性的胰島素可部分逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor I，IGF-I)和IGF-1功能肽(IGF-I potential peptide，IGF-IPP)可明顯抑制人類肝癌細(xì)胞株apoM mRNA的表達(dá)，且呈時(shí)間和劑量依賴性。但這種體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原

3、因尚不清楚。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖本身則具有抑制載脂蛋白M的表達(dá)和分泌的作用，但具體機(jī)制不明。研究發(fā)現(xiàn)高血糖可激活體內(nèi)氨基己糖途徑，導(dǎo)致內(nèi)源性葡糖胺生成增加，糖基化代謝產(chǎn)物增多。氨基己糖代謝通路是糖酵解的一大分支，我們推測(cè)高糖抑制apoM的表達(dá)和分泌是否是通過氨基己糖途徑來是實(shí)現(xiàn)的，而葡糖胺是模擬體內(nèi)氨基己糖代謝通路最常用的物質(zhì)，所以研究葡糖胺對(duì)apoM代謝的影響有助于了解高糖抑制apoM表達(dá)的原因。
　　 葡糖胺是構(gòu)成體內(nèi)粘多糖和殼質(zhì)的

4、一種含氨基單糖，通過糖代謝的重要分支氨基己糖途徑進(jìn)行代謝，具有重要的生理功能。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常規(guī)劑量的葡糖胺對(duì)體內(nèi)糖代謝穩(wěn)態(tài)無明顯影響，但各種病理?xiàng)l件下氨基己糖代謝通路過度激活后會(huì)引起一系列基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致葡萄糖利用障礙和胰島素抵抗，引起糖代謝和脂蛋白代謝的變化。但其他研究發(fā)現(xiàn)，葡糖胺可明顯減輕高血糖對(duì)血管的損傷，并具有調(diào)節(jié)脂蛋白基因表達(dá)和蛋白合成的作用。葡糖胺通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強(qiáng)化載脂蛋白B-100共翻譯期的蛋白酶水解作用和翻譯后的非蛋

5、白酶降解作用而特異性地減少載脂蛋白B-100的分泌。葡糖胺通過延長(zhǎng)載脂蛋白AlmRNA的半衰期，促進(jìn)其基因表達(dá)和蛋白分泌。葡糖胺對(duì)apoM的影響目前尚不清楚，研究?jī)烧咧g的聯(lián)系有助于更好地了解氨基己糖途徑對(duì)體內(nèi)脂蛋白代謝以及動(dòng)脈粥樣硬化過程的影響，使其成為臨床治療糖尿病、肥胖癥、高胰島素血癥和其他脂質(zhì)代謝異常的疾病的新靶點(diǎn)。
　　 第一部分葡糖胺對(duì)人肝癌細(xì)胞株載脂蛋白M基因表達(dá)的影響
　　 目的：研究葡糖胺在體外對(duì)人肝癌

6、細(xì)胞株HepG2細(xì)胞apoM和apoA1mRNA表達(dá)的影響。
　　 方法：通過在人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的葡糖胺(0、1 mmol/L和5 mmol/L)孵育24小時(shí)后提取細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)apoM和apoA1mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組apoM mRNA和apoA1 mRNA水平有差異。1mol/L葡糖胺組apoM mRNA水平較對(duì)照組增加60％(P<0.05)，而5

7、mol/L組apoMmRNA增加47.7％(P>0.05)。1mol/L和5mol/L組apoA1 mRNA較對(duì)照組分別增加1.03倍(P>0.05)和2.59倍(P<0.05)。
　　 結(jié)論：葡糖胺可促進(jìn)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞apoM和apoA1的基因表達(dá)。
　　 第二部分葡糖胺對(duì)健康SD大鼠載脂蛋白M表達(dá)和分泌的影響
　　 目的：了解外源性葡糖胺對(duì)健康成年SD大鼠apoM表達(dá)和分泌的影響。
　　

8、方法：采用健康成年SD大鼠尾靜脈置管，使用微量注射泵以2.5ml/h速度連續(xù)6小時(shí)泵入不同濃度的葡糖胺(1 mmol/L和10 mmol/L)，對(duì)照組以同樣方法泵入生理鹽水，Western-blot法檢測(cè)大鼠血清apoM的濃度變化，RT-PCR法檢測(cè)apoMmRNA的水平，同時(shí)檢測(cè)血糖、胰島素、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯和脂蛋白a的變化。
　　 結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SD大鼠尾靜脈連續(xù)灌注葡糖胺6小時(shí)后，肝臟apo

9、M mRNA水平有明顯差異(H=7.344，P=0.0254)。1mmol/L葡糖胺組較生理鹽水對(duì)照組肝臟apoMmRNA水平升高9.6％(P>0.05)，而10mmol/L葡糖胺組升高3.40倍(P<0.05)。血清apoM蛋白水平僅輕度增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=0.98，P=0.6126)。同時(shí)10mmol/L葡糖胺組HDL水平較對(duì)照組顯著升高20.3％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而甘油三酯、脂蛋白a和低密度脂蛋白無明顯變

10、化。
　　 結(jié)論：葡糖胺促進(jìn)健康成年SD大鼠肝臟apoMmRNA的表達(dá)，血清apoM蛋白水平也輕度增加。短時(shí)間的高葡糖胺狀態(tài)對(duì)血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和Lp(a)影響不大，但高密度脂蛋白明顯升高，提示葡糖胺可能具有促進(jìn)HDL合成的作用，與apoM的變化趨勢(shì)相一致。
　　 第三部分葡糖胺調(diào)節(jié)載脂蛋白M表達(dá)和分泌的機(jī)制研究
　　 目的：通過加入氨基己糖代謝途徑關(guān)鍵限速酶GFAT的抑制劑azaserine，

11、了解氨基己糖代謝通路對(duì)載脂蛋白M的影響。同時(shí)通過分別加入葡糖胺或胰島素，了解葡糖胺調(diào)節(jié)apoM的具體調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：①A組為對(duì)照組，B組加入5umol/Lazaserine，C組加入5umol/Lazaserine+10mmol/L葡糖胺，培養(yǎng)24小時(shí)后提取細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)apoMmRNA的表達(dá)水平。②A組為對(duì)照組，B組加入5mmol/L葡糖胺，C組加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素，培養(yǎng)24小時(shí)后提

12、取細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)apoM和apoA1 mRNA的表達(dá)水平。③A組為對(duì)照組，B組加入20umol/L azaserine，C組加入1ug/ml胰島素+20umol/L azaserine，D組加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素+20umol/L azaserine，培養(yǎng)24小時(shí)后提取細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)apoM和apoA1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①培養(yǎng)基中加入5umol/L azaserin

13、e后apoM mRNA水平較對(duì)照組下降35.4％(P<0.05)，而外源性葡糖胺則可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，使apoM mRNA恢復(fù)至對(duì)照組水平。②單純5mmol/L葡糖胺可使人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞apoM mRNA水平較對(duì)照組顯著升高51.1％(P<0.05)，而5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素組apoM mRNA水平較對(duì)照組升高78.2％(P<0.01)。③葡糖胺+胰島素+azaserine組apoMmRNA水平較單純azaser

14、ine組升高120％(P<0.05)，較胰島素+azaserine組升高68.9％(P<0.05)。葡糖胺+胰島素+azaserine組apoA1 mRNA水平較單純azaserine組升高3.6倍(P<0.01)，較胰島素+azaserine組升高1.85倍(P<0.01)。
　　 結(jié)論：葡糖胺通過氨基己糖通路調(diào)節(jié)apoM的基因表達(dá)，而且內(nèi)源性和外源性氨基己糖對(duì)apoM的生成同樣重要。胰島素可顯著加強(qiáng)葡糖胺對(duì)apoM表達(dá)的促進(jìn)