載脂蛋白對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分載脂蛋白E對(duì)神經(jīng)元機(jī)械損傷后軸突再生修復(fù)的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科的常見病之一，具有致死致殘率高、預(yù)后不良的特點(diǎn)，如何改善其預(yù)后仍是目前治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。神經(jīng)傳導(dǎo)通路的修復(fù)直接影響TBI的預(yù)后，其中軸突再生是神經(jīng)修復(fù)的中心環(huán)節(jié)。載脂蛋白E（ Apolipoprotein E, ApoE）是神經(jīng)系統(tǒng)最主要的載脂蛋白，已經(jīng)證實(shí)能夠改善T

2、BI預(yù)后。本課題研究ApoE蛋白對(duì)TBI后神經(jīng)元軸突再生修復(fù)的影響及機(jī)制，探討其作為TBI治療靶點(diǎn)的可能性。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)APOE基因野生鼠和APOE基因敲除鼠的原代皮層神經(jīng)元，利用移液器槍頭劃傷神經(jīng)元的方法構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械損傷模型離體模擬TBI后的神經(jīng)元損傷。
　　1）將細(xì)胞分為APOE野生鼠組和APOE敲除鼠組，在損傷后24h，對(duì)神經(jīng)元的新生軸突進(jìn)行免疫熒光染色，觀察傷后24h軸突再生的總長(zhǎng)度；
　

3、　2） Western blot檢測(cè)損傷后24h細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白（Disabled-1， Dab1)磷酸化、軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（ Growth associated protein43， GAP43）的表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建沉默野生鼠神經(jīng)元Dab1蛋白的Dab1 siRNA慢病毒載體（LV/Dab1 siRNA）。將神經(jīng)元隨機(jī)分為空載病毒組、LV/Dab1 siRNA-1、LV/Dab1 siRNA-2和 LV/Dab1 si

4、RNA-3組，在轉(zhuǎn)染后72h，western blot檢測(cè)各組Dab1蛋白的表達(dá)水平，篩選沉默效率最高的LV/Dab1 siRNA。
　　3.通過LV/Dab1 siRNA沉默野生鼠神經(jīng)元Dab1基因并構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械損傷模型。將神經(jīng)元分為以下4組：（1）陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元，沒有給予機(jī)械損傷，同一時(shí)間點(diǎn)給予血清白蛋白（10μg/ml）作為對(duì)照；（2）陽性對(duì)照組：陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元，給予機(jī)械損傷，傷后給予等劑量的血

5、清白蛋白；（3）ApoE蛋白治療組：陰性對(duì)照病毒感染神經(jīng)元，同樣給予機(jī)械損傷，在傷后給予外源性重組ApoE蛋白（10μg/ml）；（4）ApoE+LV/Dab1 siRNA組：LV/Dab1 siRNA感染神經(jīng)元，同樣給予機(jī)械損傷，在傷后給予等劑量的ApoE蛋白。
　　1）免疫熒光染色并觀察各組傷后24h的再生軸突總長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積；
　　2）Western blot檢測(cè)損傷后24h各組細(xì)胞內(nèi)的Dab1磷酸化、細(xì)

6、胞分裂周期蛋白42（Cell division control protein42，CDC42）活性以及GAP43蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.在神經(jīng)元損傷后24h， APOE野生鼠組的軸突再生總長(zhǎng)度顯著高于APOE基因敲除鼠組；此時(shí)，APOE野生鼠組的Dab1磷酸化水平顯著高于APOE基因敲除鼠組；APOE野生鼠組的GAP43表達(dá)水平也顯著高于敲除鼠組。
　　2. LV/Dab1 siRNA-1，LV/Dab

7、1 siRNA-2和LV/Dab1 siRNA-3組的Dab1蛋白表達(dá)明顯低于空載病毒組；LV/Dab1 siRNA-2組的Dab1蛋白表達(dá)水平最低。
　　3.在神經(jīng)元損傷后24h，ApoE蛋白治療組的軸突再生長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積均明顯高于沒有給予ApoE蛋白的陽性對(duì)照組。
　　4.在軸突再生修復(fù)的過程中，ApoE蛋白治療組和陽性對(duì)照組的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平均顯著高于沒有神經(jīng)元軸突再生修

8、復(fù)的陰性對(duì)照組；同時(shí)，ApoE蛋白治療組的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平均顯著高于陽性對(duì)照組。
　　5.在神經(jīng)元損傷后24h，Dab1被沉默的ApoE+LV/Dab1 siRNA組的軸突再生長(zhǎng)度、新生生長(zhǎng)錐的數(shù)量和面積明顯低于正常表達(dá)Dab1的ApoE蛋白治療組；ApoE+LV/Dab1 siRNA組的Cdc42活性和GAP43表達(dá)水平也顯著低于ApoE蛋白治療組。
　　結(jié)論：
　　皮層神經(jīng)元機(jī)械損

9、傷后因?yàn)槿狈poE蛋白導(dǎo)致軸突再生修復(fù)受到抑制；而給予ApoE蛋白能夠促進(jìn)神經(jīng)元的軸突再生修復(fù)。ApoE蛋白可能通過上調(diào)Dab1磷酸化，激活Cdc42活性，從而促進(jìn)軸突再生修復(fù)，最終改善TBI的預(yù)后。
　　第二部分載脂蛋白J對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)性病理生理損害包括氧化應(yīng)激、炎癥激活、血腦屏障破壞等，是影響病情的主要因素，但目前仍缺乏有效的干預(yù)手段。載脂蛋白J（Apoli

10、poprotein J，ApoJ）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的載脂蛋白，已經(jīng)證實(shí)在神經(jīng)免疫和神經(jīng)修復(fù)方面具有重要作用。本研究探討ApoJ蛋白對(duì)TBI的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為TBI治療提供潛在的有效治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.在C57BL/6J小鼠建立控制性皮層撞擊損傷模型（ Controlled cortex impact，CCI）在體模擬TBI。Western blot檢測(cè)ApoJ蛋白在傷前、傷后6h，1d，3d，5d，7d，

11、10d，14d，28d的表達(dá)變化。
　　2.將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和ApoJ組。假手術(shù)組和對(duì)照組傷前給予100μl5μg/mL血清白蛋白（BSA），ApoJ組傷前側(cè)腦室注射100μl5μg/mL人重組ApoJ蛋白。利用神經(jīng)損傷評(píng)分（NSS評(píng)分）和水迷宮實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估傷后小鼠的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能的恢復(fù)情況。
　　3.將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和ApoJ組，處理同上。在傷后24h，利用western blot檢測(cè)傷灶周

12、圍腦組織的氧化應(yīng)激標(biāo)志物3-NT和4-HNE，補(bǔ)體反應(yīng)產(chǎn)物C3b和C5b-9的表達(dá)水平；在傷后24h，利用PCR檢測(cè)傷灶周圍腦組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平；在傷后24h，組織免疫熒光檢測(cè)傷灶周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活反應(yīng)；在傷后7天，組織免疫熒光檢測(cè)傷側(cè)皮層和海馬存活神經(jīng)元的數(shù)量；在傷后24h，伊文思藍(lán)染色檢測(cè)雙側(cè)大腦半球的血腦屏障通透性，以及利用干濕重法檢測(cè)雙側(cè)大腦半球的腦含水量。
　　結(jié)果：<

13、br>　　1. ApoJ蛋白在CCI傷后表達(dá)明顯升高，在傷后6h表達(dá)最高，然后逐漸下降，傷后7天回到基值。
　　2. NSS評(píng)分結(jié)果顯示ApoJ組的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)顯著優(yōu)于對(duì)照組；兩組的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著差異。
　　3.傷后24h，CCI組（即對(duì)照組和ApoJ組）的氧化應(yīng)激標(biāo)志物3-NT和4-HNE顯著高于假手術(shù)組，其中ApoJ組的3-NT和4-HNE顯著低于對(duì)照組；CCI組的補(bǔ)體激活產(chǎn)物C3b和C5b-9顯著高于假手術(shù)組，

14、其中ApoJ組的補(bǔ)體途徑終產(chǎn)物C5b-9顯著低于對(duì)照組，但是ApoJ組的C3b與對(duì)照組相比沒有顯著差異。
　　4.傷后24h，CCI組IL-1β， IL-6和TNF-αmRNA水平顯著高于假手術(shù)組，其中ApoJ組的IL-1β和TNF-α顯著低于對(duì)照組，但是IL-6與對(duì)照組相比沒有顯著差異。
　　5.傷后24h，CCI組的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量顯著高于假手術(shù)組，ApoJ組的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量顯著低于對(duì)照

15、組；傷后7天，CCI組的皮層及海馬神經(jīng)元存活數(shù)量明顯低于假手術(shù)組，其中ApoJ組的皮層及海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對(duì)照重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文組。
　　6.傷后24h，CCI組的傷側(cè)大腦半球血腦屏障通透性明顯高于假手術(shù)組，其中ApoJ組的血腦屏障通透性顯著低于對(duì)照組；CCI組傷側(cè)大腦半球含水量也明顯高于假手術(shù)組，其中ApoJ組的傷側(cè)大腦半球含水量顯著低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　ApoJ蛋白可以改善小鼠TBI后