蓓薩羅丁對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、蓓薩羅丁對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用
　　目的：評(píng)估蓓薩羅丁對小鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic brain injury,TBI）后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，探討蓓薩羅丁治療TBI的可能性。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：蓓薩羅丁對小鼠TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　雄性、12周齡、體重20-22克的C57BL/6小鼠90只按隨機(jī)數(shù)字表分為以下幾組：假手術(shù)組（n=30），溶劑對照組（n=30），蓓薩

2、羅丁組（n=30）。在TBI-0310顱腦創(chuàng)傷儀上按如下參數(shù)建立控制性皮質(zhì)損傷模型來模擬TBI,參數(shù)為：撞擊速度5m/s，撞擊探頭直徑3mm，接觸時(shí)間100ms，撞擊深度2mm。蓓薩羅丁組和溶劑對照組接受TBI打擊，假手術(shù)組不接受打擊。在術(shù)后兩小時(shí)和術(shù)后每天，蓓薩羅丁組按5mg/kg/day劑量給予蓓薩羅丁，溶劑對照組則給予等量的溶劑，假手術(shù)組不給予任何藥物或溶劑處理。在傷前、傷后第1、3、7、14天通過神經(jīng)功能缺失程度評(píng)分（Neuro

3、logical severity score，NSS）、抓線測試、轉(zhuǎn)棒測試對小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。在TBI后15-19天，通過莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)能力和空間記憶功能。
　　實(shí)驗(yàn)二：蓓薩羅丁對小鼠TBI傷灶周圍炎癥水平的影響
　　在TBI后第1、3、7天，取小鼠TBI傷灶周圍的腦組織約10mg提取蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測組織中的炎癥

4、因子白細(xì)胞介素-1b（Interleukin1b，IL-1b）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）的含量。在TBI后第7天，經(jīng)心臟灌注后取各組小鼠大腦進(jìn)行冰凍切片，再行免疫熒光染色檢測腦切片中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1的表達(dá)達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)三：蓓薩羅丁對小鼠TBI傷灶周圍細(xì)胞凋亡水平的影響
　　在TBI后第1、3、7天，取小鼠TBI傷灶周圍的腦組織約50mg提取蛋白，用蛋

5、白印記法檢測組織中活化的凋亡蛋白酶3的含量。在TBI后第7天，經(jīng)心臟灌注后取各組小鼠大腦制作石蠟切片和冰凍切片，用石蠟切片行TUNEL染色檢測切片中組織細(xì)胞的DNA斷裂情況，以此反映凋亡情況，再用冰凍切片行免疫熒光染色檢測腦切片中活化凋亡蛋白酶3的表達(dá)達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)四：蓓薩羅丁對小鼠的副作用檢測
　　在完成所有的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測后，首先稱取小鼠體重，再用抗凝管取小鼠的靜脈血并離心獲取血漿，用試劑盒檢測血漿甘油三酯濃度。再將

6、小鼠斷頭處死，取出肝臟稱重，計(jì)算肝臟重量與體重的比值，最后用肝臟制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟顯微結(jié)構(gòu)有無改變。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：
　　在TBI后3天、7天、14天，與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁組小鼠的NSS評(píng)分顯著降低，差異有顯著性（P＜0.05），提示蓓薩羅丁顯著改善小鼠的神經(jīng)功能。在TBI后1天，與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁組小鼠的抓線成績顯著升高，差異有顯著性（P＜0.05），提示蓓薩羅丁顯著

7、改善小鼠的抓線能力。在TBI后1天、3天、7天、14天，與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁組小鼠的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯延長，差異有顯著性（P＜0.05），提示蓓薩羅丁顯著改善小鼠的平衡運(yùn)動(dòng)功能。在TBI后15至19天，與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁組小鼠找到隱藏平臺(tái)所用時(shí)間并未顯著縮短（P＞0.05），提示蓓薩羅丁并未顯著改善小鼠 TBI傷后的學(xué)習(xí)能力。在TBI后第20天，與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁顯著增加了小鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間和路程（P＜0.0

8、5），表明蓓薩羅丁改善了小鼠TBI后的空間記憶功能。
　　實(shí)驗(yàn)二：
　　在TBI后，蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中的IL-1b、IL-6、TNF-α濃度也都顯著上升，IL-1b和IL-6的濃度均在TBI后1天達(dá)最高值，TNF-α濃度在TBI后第3天達(dá)最高值。在TBI后第7天，蓓薩羅丁組小鼠的IL-1b和IL-6濃度均低于溶劑對照組，差異具有顯著性（P＜0.05）；在TBI后第1天和第7天，蓓薩羅丁組小鼠的TNF-α濃度顯著低

9、于溶劑對照組（P＜0.05），這些結(jié)果表明蓓薩羅丁的治療顯著降低炎癥因子水平。與假手術(shù)組相比，溶劑對照組和蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與溶劑對照組小鼠相比，蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），表明蓓薩羅丁顯著抑制TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞在傷灶周圍的聚集。
　　實(shí)驗(yàn)三：
　　溶劑對照組和蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中活化的凋亡蛋白酶-3

10、的水平均在TBI以后第1天達(dá)到最高值，而后逐漸下降，均在傷后第7天最低。蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中活化的凋亡蛋白酶-3的水平在TBI后第1、3、7天均顯著低于溶劑對照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在用免疫熒光檢測該蛋白酶水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，溶劑對照組和蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中活化的凋亡蛋白酶-3的水平均在TBI后第7天顯著升高（P＜0.05）。蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍腦組織中活化的凋亡蛋白酶-3的水平在TBI

11、后第7天顯著低于溶劑對照組的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與溶劑對照組相比，蓓薩羅丁組小鼠傷灶周圍Tunel染色陽性細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明蓓薩羅丁顯著降低TBI后小鼠傷灶周圍腦組織中的細(xì)胞凋亡水平。
　　實(shí)驗(yàn)四：
　　與溶劑對照組和假手術(shù)組相比，蓓薩羅丁組的血漿甘油三酯濃度并未顯著升高（P＞0.05），而且小鼠肝臟重量也未顯著改變（P＞0.05）。在本實(shí)驗(yàn)中的假手術(shù)組、溶劑對照組和蓓薩

12、羅丁組均可觀察到大量形態(tài)正常的肝小葉，且在蓓薩羅丁組并未觀察到肝臟結(jié)構(gòu)的紊亂，也沒有觀察到假小葉形成。這些結(jié)果表明連續(xù)21天以“5mg/kg/day”的劑量給予蓓薩羅丁并未引起顯著的副作用。
　　結(jié)論：低劑量的蓓薩羅丁顯著減輕小鼠TBI后傷灶周圍腦組織中的炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，最終顯著促進(jìn)TBI后小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，且并不產(chǎn)生毒副作用。
　　第二部分、長鏈非編碼RNA Neat1在蓓薩羅丁的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中所發(fā)揮的作用

13、>　　目的：從非編碼RNA的角度研究蓓薩羅丁發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：蓓薩羅丁對細(xì)胞的最佳治療劑量以及其對各亞型RXR受體的影響
　　培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞株，用以下濃度梯度的蓓薩羅丁溶液處理細(xì)胞：0.1μM，0.3μM，0.9μM，2.7μM，8.1μM和24.3μM，再將細(xì)胞予以氧糖剝奪（Oxygen glucose deprivation, OGD）刺激，用MTT法檢測細(xì)胞活力，觀察

14、不同濃度的蓓薩羅丁在正常和 OGD情況下對細(xì)胞活力的影響，篩選出蓓薩羅丁處理細(xì)胞的最佳濃度，再用此濃度處理HT22細(xì)胞后提取總蛋白，用ELISA法檢測RXR各亞型的表達(dá)情況。再經(jīng)腹腔注射給予C57BL/6小鼠低濃度的蓓薩羅丁處理，并提取大腦皮層蛋白用于檢測RXR各亞型的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)二：RXR-α與Neat1基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況
　　首先用生物信息學(xué)技術(shù)分析在Neat1基因啟動(dòng)子區(qū)的潛在RXR-α結(jié)合位點(diǎn)。再用甲醛處理

15、HT22細(xì)胞使之形成蛋白交鏈，清洗后加入蛋白裂解液并提取純化的蛋白，再將其置于RXR-α共沉淀系統(tǒng)中處理，用經(jīng)RXR-α沉淀下來的混合物來提取DNA，最后用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）來驗(yàn)證該共沉淀產(chǎn)物中是否存在Neat1基因啟動(dòng)子的DNA片段。再將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由凝膠電泳驗(yàn)證目的DNA片段的真實(shí)性。
　　實(shí)驗(yàn)三：RXR-α與Neat1基因啟動(dòng)子結(jié)合后是否對Neat1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生

16、影響
　　用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)來驗(yàn)證RXR-α與Neat1啟動(dòng)子結(jié)合后會(huì)影響啟動(dòng)子活力，首先構(gòu)建pcDNA3.1(+)-RXR-α質(zhì)粒和pGL3-Basic-Neat1-promoter質(zhì)粒，將它們都共同轉(zhuǎn)化至目的細(xì)胞中，以海腎螢光素酶載體作為對照，再通過檢測熒光強(qiáng)度來分析螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，以此判斷RXR-α是否影響了Neat1啟動(dòng)子的活性。用蓓薩羅丁處理HT22細(xì)胞并提取其總RNA，用PCR檢測Neat

17、1基因的長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在經(jīng)蓓薩羅丁處理后如何變化。再用蓓薩羅丁處理小鼠并提取其大腦皮層的總RNA，檢測Neat1lncRNA的變化情況。另外，檢測在OGD處理后的HT22細(xì)胞中以及在遭受TBI打擊后的小鼠大腦皮層中的Neat1lncRNA的變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)四：與Neat1lncRNA直接結(jié)合的蛋白
　　首先用PCR的方法制成Neat1lncRNA的全長鏈探

18、針，再提取在正常條件和OGD條件下的HT22細(xì)胞的總蛋白，將總蛋白與Neat1lncRNA探針孵育，再用RNA-pulldown技術(shù)收集被Neat1lncRNA捕獲的蛋白。將捕獲的蛋白經(jīng)凝膠電泳分離，切取目的條帶進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測，以確定蛋白的種類和相對豐度。用蛋白印跡的方法驗(yàn)證目的蛋白質(zhì)譜結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)五：Neat1對細(xì)胞炎癥和凋亡的影響以及PIDD1蛋白在其中所扮演的角色
　　首先構(gòu)建沉默Neat1基因、沉默PIDD1基

19、因以及過表達(dá)Neat1基因的腺病毒，再用它們分別感染HT22細(xì)胞和BV2細(xì)胞。用OGD處理HT22細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，觀察在不同的Neat1lncRNA和PIDD1表達(dá)水平下細(xì)胞凋亡率的變化情況。用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BV2細(xì)胞誘發(fā)炎癥反應(yīng)，觀察在不同的Neat1lncRNA和PIDD1表達(dá)水平下炎癥水平的變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)六：Neat1lncRNA對C57BL/6小鼠TBI后傷灶周圍炎癥、凋

20、亡以及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　首先經(jīng)側(cè)腦室分別注射Neat1基因沉默腺病毒或Neat1基因過表達(dá)腺病毒，用PCR法檢測它們對腦組織中Neat1lncRNA的干擾效率，再用這些小鼠制作TBI模型。用ELISA法檢測傷灶周圍炎癥因子IL-1b、TNF-α的含量，用TUNEL法聯(lián)合蛋白印跡法檢測傷灶周圍細(xì)胞凋亡水平。再進(jìn)行NSS測評(píng)、旋轉(zhuǎn)木實(shí)驗(yàn)、抓線實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)功能以及空間記憶功能。
　　結(jié)果：

21、　　實(shí)驗(yàn)一：
　　當(dāng)蓓薩羅丁濃度小于8.1μM時(shí)，對HT22細(xì)胞活力不產(chǎn)生顯著的傷害性作用（P＞0.05），但當(dāng)其濃度大于24.3μM時(shí)，則顯著降低HT22細(xì)胞活力（P＜0.05）。當(dāng)細(xì)胞處于氧糖剝奪的環(huán)境時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低甚至凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)2.7μM和8.1μM的蓓薩羅丁均能顯著改善氧糖剝奪環(huán)境中的細(xì)胞活力（P＜0.05），而8.1μM的效果最佳（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)在給予8.1μM蓓薩羅丁持續(xù)治療 HT22細(xì)胞4天后

22、，僅RXR-α蛋白含量顯著增加（P＜0.01），而RXR-β和RXR-γ蛋白含量并未受到顯著影響（P＞0.05）。在以5mg/kg/day的劑量連續(xù)治療C57BL/6小鼠4天后，小鼠皮層腦組織中RXR-α蛋白含量顯著增加（P＜0.01），而RXR-β和RXR-γ蛋白含量并未顯著改變（P＞0.05）。以上結(jié)果表明受蓓薩羅丁影響最明顯的亞型是RXR-α。
　　實(shí)驗(yàn)二：
　　通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在Neat1基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在

23、兩個(gè)潛在的RXR-α結(jié)合位點(diǎn)。通過共沉淀和后續(xù)的PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在RXR-α蛋白所釣取的DNA片段中檢測到有Neat1基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)1（chr19:5,845,979-5,846,077，TGACGTCA），但是沒有檢測到結(jié)合位點(diǎn)2（chr19:5,845,482-5,845,593，TATAAA），且進(jìn)一步的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了前一步PCR檢測結(jié)果的正確性。但在IgG所釣取的DNA中未檢測到Neat1結(jié)合位點(diǎn)。以上結(jié)果表明，在N

24、eat1基因的啟動(dòng)子區(qū)存在RXR-α的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合序列為TGACGTCA，在染色體上的位置為chr19:5,845,979-5,846,077。
　　實(shí)驗(yàn)三：
　　在轉(zhuǎn)化了pGL3-basic空載體和pcDNA3.1空載體的HT22細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶活性（1±0.2）極低；在轉(zhuǎn)化了pGL3-basic空載體和RXR-α基因重組質(zhì)粒的HT22細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶活性（0.35±0.02）也非常低。但是在轉(zhuǎn)化了Neat1啟動(dòng)

25、子質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體的細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶活性（298.77±75.54）較高；在轉(zhuǎn)化了Neat1啟動(dòng)子質(zhì)粒和RXR-α基因重組質(zhì)粒的細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶活性（814.20±55.59）極高。而且，同時(shí)轉(zhuǎn)化了Neat1啟動(dòng)子質(zhì)粒和RXR-α基因重組質(zhì)粒的細(xì)胞其螢火蟲熒光素酶的活性顯著強(qiáng)于其余各組（P＜0.05），表明RXR-α顯著增強(qiáng)Neat1基因啟動(dòng)子的活性。
　　在正常培養(yǎng)條件下，蓓薩羅丁（8.1μM）連續(xù)治療 HT

26、22細(xì)胞4天后其Neat1 lncRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。當(dāng)HT22細(xì)胞處于糖氧剝奪條件下時(shí)，Neat1 lncRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05），而且在此條件下給予蓓薩羅丁治療會(huì)進(jìn)一步顯著提高Neat1 lncRNA水平（P＜0.05）。連續(xù)4天給予正常C57BL/6小鼠蓓薩羅?。?mg/kg/day）治療后，顯著增加了小鼠大腦皮層中的Neat1 lncRNA含量（P＜0.05）。當(dāng)小鼠遭受TBI打擊后，其傷灶周圍大腦皮層

27、中的Neat1 lncRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05），此外，在此條件下給予小鼠蓓薩羅丁治療會(huì)進(jìn)一步增加傷灶周圍皮層中的Neat1 lncRNA含量（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四：
　　將共沉淀的蛋白經(jīng)凝膠電泳后，切取了4個(gè)差異性條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，共發(fā)現(xiàn)20種非旁斑蛋白能與Neat1lncRNA直接結(jié)合，這其中就包括了PIDD1這一與凋亡和炎癥密切相關(guān)的蛋白。
　　實(shí)驗(yàn)五：
　　PIDD1基因沉默顯著抑制了LP

28、S所誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生（P＜0.05），表明PIDD1基因具有促進(jìn)炎癥的功能。Neat1基因沉默可進(jìn)一步促進(jìn)LPS所誘導(dǎo)的炎癥因子大量產(chǎn)生（P＜0.05），但Neat1基因過表達(dá)則顯著抑制其產(chǎn)生（P＜0.05），這表明Neat1基因具有顯著的炎癥抑制作用。此外，在Neat1基因沉默的情況下同時(shí)沉默PIDD1基因，可顯著抑制Neat1基因沉默所引起的促炎癥因子產(chǎn)生作用（P＜0.05）。OGD刺激引起了明顯的HT22細(xì)胞凋亡（P＜0.01）

29、，但Neat1基因過表達(dá)可以顯著減輕OGD所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡（P＜0.05）,而Neat1基因沉默可以進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡（P＜0.05），這表明Neat1基因具有抗凋亡作用。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，PIDD1基因下調(diào)顯著抑制了細(xì)胞凋亡，這也表明PIDD1基因具有促凋亡作用（P＜0.05）。另外，在Neat1基因沉默的情況下同時(shí)沉默PIDD1基因，可顯著抑制Neat1基因沉默所引起的促凋亡作用（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)六：
　　經(jīng)側(cè)

30、腦室注射的腺病毒顯著地改變了腦組織中Neat1lncRNA水平（P＜0.05）。Neat1基因過表達(dá)顯著減少了TBI傷灶周圍腦組織中炎癥因子的含量并降低細(xì)胞凋亡水平（P＜0.05），而Neat1基因沉默則顯著增加了TBI傷灶周圍腦組織中炎癥因子的含量并提高了細(xì)胞凋亡水平（P＜0.05）。此外，Neat1基因過表達(dá)顯著促進(jìn)了小鼠TBI后的運(yùn)動(dòng)功能和空間記憶功能的恢復(fù)（P＜0.05），而Neat1基因沉默則阻礙了小鼠運(yùn)動(dòng)功能和空間記憶功能的