創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)源性機(jī)制及其干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是致死致殘率很高的一種常見(jiàn)病。除原發(fā)性腦損傷外，繼發(fā)性腦損傷對(duì)TBI的預(yù)后也起著重要影響。目前有關(guān)TBI的發(fā)生發(fā)展機(jī)理至今尚未完全明確，國(guó)內(nèi)外有多種學(xué)說(shuō)，如：血腦屏障學(xué)說(shuō)，鈣通道學(xué)說(shuō)，自由基學(xué)說(shuō)，腦微循環(huán)學(xué)說(shuō)，能量代謝學(xué)說(shuō)等。但上述學(xué)說(shuō)沒(méi)有一種能完全解釋清TBI發(fā)病機(jī)理，這是因?yàn)閯?chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生機(jī)理是十分復(fù)雜的。上述的各種機(jī)制并非孤立存在、單獨(dú)起作用，而是相互影響、多種機(jī)制共同起作用的結(jié)果。近

2、年來(lái)，神經(jīng)源性炎癥在TBI中的作用機(jī)制逐漸引起人們的重視，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽Y（NPY）、降鈣素相關(guān)基因肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）、水通道蛋白-4（AQP4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等在TBI后神經(jīng)源性炎癥中扮演重要角色。本課題提出“創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機(jī)制”假說(shuō)，正是基于神經(jīng)源性炎癥。假說(shuō)主要內(nèi)容：TBI后，腦組織內(nèi)許多神經(jīng)化學(xué)和細(xì)胞介質(zhì)發(fā)生改變，并且組織內(nèi)發(fā)生類(lèi)似神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)或者/和疼痛作為應(yīng)激性刺激通過(guò)復(fù)

3、雜的神經(jīng)源性機(jī)制誘發(fā)的腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常，導(dǎo)致或者加劇腦組織內(nèi)生物學(xué)活性物質(zhì)產(chǎn)生與代謝失衡，引起腦細(xì)胞的損傷，從而加劇損傷區(qū)腦組織的損傷，并且引起損傷區(qū)周?chē)X組織的損傷反應(yīng)，引發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫，造成繼發(fā)性顱腦損害，即①神經(jīng)源性炎癥或損傷刺激直接或經(jīng)傳導(dǎo)作用于腦細(xì)胞→胞體分泌神經(jīng)肽增加→神經(jīng)突觸間神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多→離子通道活動(dòng)增加→動(dòng)作電位活動(dòng)增加，并由突觸部位擴(kuò)散到胞體→胞體鈉、鈣通道活動(dòng)增加→導(dǎo)致水鈉儲(chǔ)留，鈣超載→細(xì)胞性腦水腫。②

4、神經(jīng)源性炎癥產(chǎn)生的生物學(xué)活性物質(zhì)（如SP）作用于腦血管及水通道-4（AQP4）→AQP4活動(dòng)增強(qiáng)（在朝向血管面及軟腦膜面的膠質(zhì)細(xì)胞膜區(qū)有選擇性的高表達(dá)），腦血管通透性增加，膠質(zhì)細(xì)胞水腫→血腦屏障（BBB）通透性增加，血管內(nèi)容滲出增多，間隙性水腫→血管源性腦水腫。①②共同導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦水腫，引起顱內(nèi)高壓，此時(shí)如不采取措施（脫水、激素、手術(shù)）阻止其發(fā)展，那將會(huì)有更多的腦細(xì)胞死亡，炎癥加劇，水腫加重，形成惡性循環(huán)，直至腦疝死亡。如果上述假設(shè)成立

5、，通過(guò)干預(yù)或阻斷上述環(huán)節(jié)均可能減輕組織損傷，這為我們尋找開(kāi)發(fā)新藥治療創(chuàng)傷性腦損傷提供了新的思路。
　　研究目的：
　　1、探討創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機(jī)制，即顱腦創(chuàng)傷導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦水腫引起腦組織損傷性改變的具體機(jī)制。（第一部分實(shí)驗(yàn)要解決的問(wèn)題）
　　2、探討使用各種受體拮抗劑，能否減輕和抑制上述損傷性改變。（第二部分實(shí)驗(yàn)要解決的問(wèn)題）
　　研究方法：
　　1.第一部分實(shí)驗(yàn)，采用Wistar雄性大鼠40只，體重2

6、80±10g，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組），輕度創(chuàng)傷組（M1組），中度創(chuàng)傷(M2組),重度創(chuàng)傷組（S組），以上4組每組10只。用Feeney按自由落體致傷原理制作TBI大鼠模型，傷后記錄丘腦腹后內(nèi)側(cè)核（VPM）痛敏神經(jīng)元（PSN）放電頻率，1h后斷頭取血，開(kāi)顱取腦。通過(guò)肉眼大體觀測(cè)各組大鼠腦皮層損傷處及其周邊腦組織損傷程度；光鏡蘇木精—伊紅染色法(HE)從組織細(xì)胞水平觀測(cè)大鼠腦組織損傷程度;透射電鏡超微結(jié)構(gòu)水平觀測(cè)大鼠腦皮層損傷處及其周

7、邊腦組織損傷程度;免疫組化檢測(cè)大鼠腦皮層損傷處及其周邊腦細(xì)胞中SP、NPY、CGRP、NF-κB、AQP4陽(yáng)性表達(dá)情況;Westernblot檢測(cè)大腦皮質(zhì)損傷區(qū)AQP4蛋白表達(dá)情況;RT-PCR檢測(cè)SP、NPY、CGRP、NF-κB、NSE和AQP-4基因表達(dá)水平;ELISA法測(cè)定血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、緩激肽（BK）、前列腺素E2（PGE2）、組織胺（HA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）、高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）含

8、量;激光共聚焦熒光離子成像實(shí)驗(yàn)測(cè)定腦細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度，檢測(cè)鈣超載情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠腦皮層細(xì)胞亞二倍體比率，了解腦細(xì)胞凋亡情況;多通道電生理記錄儀記錄分析VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率。對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，做相關(guān)性研究。從組織形態(tài)學(xué)、蛋白學(xué)、基因?qū)W、血清學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)多角度研究創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機(jī)制。
　　2．第二部分第一章干預(yù)實(shí)驗(yàn)--NK1受體拮抗劑L-703,606對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)

9、驗(yàn)研究，采用45只Wistar雄性大鼠，體重280±10g，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（C組），L-703,606干預(yù)組（L組），TBI創(chuàng)傷未干預(yù)組(T組),以上3組每組15只。TBI造模成功后立即尾靜脈給予NK1受體拮抗劑L-703,606(250nmol/kgSigma公司),然后于造模后1h斷頭取血，開(kāi)顱取腦，HE染色觀察各組鼠腦損傷情況；免疫組化染色檢測(cè)SP、CGRP、NF-κB表達(dá)情況；RT-PCR檢測(cè)SP、CGRP、NF-κB、N

10、SE、AQP4mRNA基因表達(dá)；ELISA法測(cè)定血清中NSE、hs-CRP；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述指標(biāo)，研究P物質(zhì)受體-NK1受體拮抗劑L-703,606干預(yù)效果。
　　3.第二部分第二章干預(yù)實(shí)驗(yàn)--Rho激酶抑制劑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后腦細(xì)胞內(nèi)亞二倍體比率的影響及其意義，采用健康成年雄性Wistar大鼠45只，體重280±10g,隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組（Sham組），創(chuàng)傷組（TBI組）和Rho激酶抑制劑干預(yù)組（FSD組），每組15只。造模后

11、采用流式細(xì)胞儀（FCM)檢測(cè)鼠腦創(chuàng)傷區(qū)皮層細(xì)胞亞二倍體比率，了解使用Rho激酶抑制劑（Fasudil）后使TBI細(xì)胞凋亡改善情況。
　　研究結(jié)果
　　1．第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨打擊程度加重，鼠腦水腫越明顯、腦細(xì)胞、線粒體腫脹越明顯，并可見(jiàn)神經(jīng)突觸間釋放神經(jīng)遞質(zhì)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；SP、NPY、CGRP、NF-κB、AQP4、NSE基因表達(dá)與蛋白陽(yáng)性表達(dá)成正相關(guān)性，且損傷越重，基因表達(dá)越強(qiáng)，其對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性蛋白含量表達(dá)也越多;致痛物

12、質(zhì)BK、PGE2、HA與致痛致炎神經(jīng)遞質(zhì)-SP基因蛋白表達(dá)水平成正相關(guān)；SP與VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率成正相關(guān)性，致痛物質(zhì)-P物質(zhì)表達(dá)含量越高，VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率越高；SP與神經(jīng)肽-NPY、CGRP之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達(dá)及釋放越多，神經(jīng)肽NPY和CGRP表達(dá)越多；SP與炎癥因子-核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-κB)及炎癥反應(yīng)指標(biāo)-高敏感性C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達(dá)及釋放越多，炎癥反應(yīng)指標(biāo)hs-CRP和NF

13、-κB表達(dá)越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，NF-κB與hs-CRP之間也呈正相關(guān)性，NF-κB表達(dá)越多，血清hs-CRP含量越高，炎癥反應(yīng)越重；SP與基質(zhì)蛋白水解酶9(MMP-9)、水通道蛋白AQP4表達(dá)之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達(dá)及釋放越多，MMP-9含量增多，降解和破壞血管內(nèi)皮基膜的能力越強(qiáng)，引起血管通透性增加，炎性物質(zhì)滲出增多，導(dǎo)致血管源性腦水腫,P物質(zhì)表達(dá)越多可引起AQP4表達(dá)也增多，引起細(xì)胞膜通透性增高，導(dǎo)致細(xì)胞性腦水腫;SP與損傷皮層腦

14、細(xì)胞鈣離子含量及細(xì)胞凋亡指標(biāo)-亞二倍體（Hd）比率之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達(dá)及釋放越多，損傷皮層腦細(xì)胞鈣離子含量越高（鈣超載現(xiàn)象越嚴(yán)重），腦細(xì)胞亞二倍體（Hd）比率也越高（細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重）；SP與神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）之間成正相關(guān)，P物質(zhì)表達(dá)越多，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞壞死越多，NSE表達(dá)及含量也越高;NPY、CGRP與NF-κB之間成正相關(guān)性，TBI后NPY、CGRP表達(dá)越高，NF-κB表達(dá)也越高，炎癥反應(yīng)也越重；NF-κB

15、與NSE、AQP4、鈣離子濃度、亞二倍體（Hd）比率之間成正相關(guān)性，TBI后NF-κB表達(dá)越高，炎癥反應(yīng)越重，NSE(反映神經(jīng)細(xì)胞損傷)、AQP4（反映細(xì)胞性腦水腫）、鈣離子濃度（反映鈣超載）和亞二倍體（反映腦細(xì)胞凋亡）比率也越高。（P均﹤0.05）
　　2.第二部分L-703,606對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示L-703,606干預(yù)組（L組）明顯較TBI未干預(yù)組（T組）損傷減輕，僅有輕度充血，少量炎性細(xì)胞浸

16、潤(rùn);L組和T組大鼠腦皮層損傷區(qū)腦組織SP、CGRP和NF-κB陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)有明顯增強(qiáng)（P﹤0.05），L組較T組表達(dá)明顯降低；L組和T組大鼠腦皮層損傷區(qū)腦組織SP、CGRP、NF-κB、AQP-4和NSE基因表達(dá)水平較對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)有明顯增強(qiáng)（P﹤0.05），且L組較T組表達(dá)明顯降低（P﹤0.05）；L組和T組大鼠血清中hs-CRP和NSE含量較對(duì)照組明顯增高（P﹤0.05），且L組較T組hs-CRP和NSE含量明顯降低。<

17、br>　　3.第二部分Rho激酶抑制劑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后腦細(xì)胞內(nèi)亞二倍體比率的影響及其意義實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Sham組、TBI組和FSD組的創(chuàng)傷區(qū)皮層細(xì)胞亞二倍體比率（％）分別為1.58±0.35，15.90±3.91和5.35±2.10，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且FSD組能較TBI組明顯降低腦細(xì)胞內(nèi)亞二倍體比率，因而可減輕TBI后腦細(xì)胞凋亡，具有腦保護(hù)作用。
　　結(jié)論
　　1．神經(jīng)源性炎癥、神經(jīng)源性機(jī)制在創(chuàng)傷

18、性腦損傷中發(fā)揮重要作用；
　　2.NK1受體拮抗劑L-703,606對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有保護(hù)作用；
　　3.Rho激酶抑制劑（Fasudil）能降低腦細(xì)胞內(nèi)亞二倍體比率，對(duì)TBI后腦組織具有保護(hù)作用；
　　4.其他受體拮抗劑，如CGRP拮抗劑CGRP8-37、NPY拮抗劑BIBP3226,芬太尼痛覺(jué)干預(yù),PDTC干預(yù)NF-κB,小劑量多巴胺抑制APQ4表達(dá)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）聯(lián)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）