膜聯(lián)蛋白A2對(duì)創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　血腦屏障主要是指單層的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的腦毛細(xì)血管壁，其能夠選擇性地使血液中的溶質(zhì)進(jìn)入到腦組織中，為腦組織創(chuàng)造了一個(gè)健康的微環(huán)境，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理活動(dòng)有重要的作用。創(chuàng)傷性腦外傷作為血腦屏障損傷最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已經(jīng)成為世界上高致死率和致殘率的主要疾病。患者在腦外傷后，血腦屏障的功能失調(diào)，使血液中大量的炎癥分子進(jìn)入到腦組織，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的二次損傷，是創(chuàng)傷性腦外傷治療的難點(diǎn)所在。到目前為止，已經(jīng)

2、報(bào)道過(guò)有很多分子通路參與了生理狀態(tài)下血腦屏障的功能調(diào)控，但是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下參與血腦屏障功能調(diào)控的分子十分有限。
　　膜聯(lián)蛋白(Annexins)家族是鈣離子依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白家族，膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)作為其中的一個(gè)重要成員，在自身免疫疾病、出血綜合癥以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其在血腦屏障中的作用目前尚不清楚。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架

3、分布以及細(xì)胞間的緊密程度。由于Annexins家族具有高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，而膜聯(lián)蛋白A2也參與調(diào)控細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)（內(nèi)吞和胞吐），故在本研究中，我們提出假設(shè):膜聯(lián)蛋白A2是一個(gè)調(diào)控血腦屏障功能的重要分子，是一個(gè)治療因血腦屏障失調(diào)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在靶點(diǎn)。本研究的闡明，為篩選治療創(chuàng)傷性腦外傷潛在的分子靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)更加高效地保護(hù)血腦屏障功能失調(diào)的藥物提供了新的方向，具有重要的臨床意義，是當(dāng)前迫切需要探索和解決的重要科學(xué)

4、前沿問(wèn)題。
　　研究方法：
　　胚胎期血腦屏障功能測(cè)定
　　孕鼠吸入麻醉后，將胚胎暴露，臍帶仍然和母體相連，使用Hmailton注射器將5μl示蹤劑注射進(jìn)入胚胎的肝臟中(4 mg/ml)，使染料通過(guò)肝臟循壞三分鐘，然后取胚胎腦組織放入4％多聚甲醛中，冷室過(guò)夜，次日放入30％蔗糖溶液中脫水。
　　成年鼠血腦屏障功能測(cè)定
　　小鼠吸入麻醉后，暴露心臟，將10-15 ml EZ連接NHS磺基生物素(0.5 mg/

5、ml)通過(guò)左心室注入，循環(huán)五分鐘后，使用磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate bufferedsaline，PBS)灌注。取出腦組織放入4％多聚甲醛中，冷室過(guò)夜，次日放入30％蔗糖溶液中脫水。
　　受控皮質(zhì)沖擊手術(shù)模型
　　暴露解剖標(biāo)志LAMBDA（尾椎方面）和前囟門(mén)（正面的方面）。在LAMBDA和前囪門(mén)和（1毫米遠(yuǎn)離中線）繪制中心圓（直徑5毫米）。使用鉆孔沿標(biāo)記的圓圈切割，鑷子去除骨暴露硬腦膜。致動(dòng)器的速度:5米/秒;變

6、形深度:0.6毫米;調(diào)節(jié)筆尖（直徑3毫米）在平行于沖擊部位的表面的角度。
　　細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)
　　將HBMEC接種于膠原蛋白鋪墊過(guò)的1.0μm遷移小室中，將小室置于24孔板中，給藥處理后，加入辣根過(guò)氧化物酶至小室的培養(yǎng)基中，終濃度為100μg/ml;60分鐘后，收集小室下面孔中的培養(yǎng)基，加入鄰甲氧基苯酚和雙氧水，至終濃度為0.5 mM（鄰甲氧基苯酚），0.6 mM（雙氧水）。顯色后，在吸收波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀中測(cè)量從小

7、室中滲漏出的辣根過(guò)氧化物酶的量。
　　研究結(jié)果：
　　1.膜聯(lián)蛋白A2在血腦屏障功能形成和成熟中的重要作用
　　在野生型小鼠和A2-/-小鼠胚胎期13.5天，10 kDa的示蹤劑已經(jīng)聚集于野生型小鼠的腦血管中，沒(méi)有滲漏現(xiàn)象。在A2-/-小鼠皮層位置，卻觀察到該示蹤劑有滲漏現(xiàn)象。在A2-/-小鼠胚胎期15.5天，10 kDa示蹤劑也聚集于腦血管中，表明隨著發(fā)育，A2-/-小鼠的血腦屏障功能也在完善。值得注意的是，在A2-

8、/-小鼠胚胎期15.5天，550 Da小分子示蹤劑仍然存在滲漏，野生型小鼠卻沒(méi)有滲漏。在出生后4天以及成年12周的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦組織中，也觀察到了同樣的現(xiàn)象。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示膜聯(lián)蛋白A2參與血腦屏障功能形成和成熟，并且膜聯(lián)蛋白A2的缺失會(huì)導(dǎo)致血腦屏障對(duì)小分子的滲漏增加。
　　提取三個(gè)月大的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦徽血管內(nèi)皮細(xì)胞，分析連接復(fù)合體的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與野生型小鼠比較，緊密連接蛋白:ZO-1、

9、Claudin-5、粘附連接蛋白VE-cadherin的表達(dá)在A2-/-小鼠腦徽血管中明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)證明膜聯(lián)蛋白A2的缺失會(huì)造成血腦屏障的功能失調(diào)。
　　2.膜聯(lián)蛋白A2對(duì)創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護(hù)作用
　　受控皮質(zhì)沖擊手術(shù)(Controlled cordical impact models，CCI)后24小時(shí)，通過(guò)尾靜脈注射10 kDa的熒光示蹤劑可以發(fā)現(xiàn)A2-/-小鼠血管滲漏的程度高于野生型小鼠。在埃文斯藍(lán)測(cè)定血腦屏障

10、功能的實(shí)驗(yàn)中，也得到了相似的結(jié)果。隨后提取腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)連接復(fù)合體的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型小鼠，A2-/-小鼠中緊密連接蛋白:ZO-1、Occludin、Claudin-5、粘附連接蛋白:VE-cadherin的表達(dá)均明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)均表明膜聯(lián)蛋白A2的缺失造成了腦外傷對(duì)血腦屏障更嚴(yán)重的損傷。CCI手術(shù)后2小時(shí)，尾靜脈注射不同劑量的重組膜聯(lián)蛋白A2(Recombinant annexin A2，rA2)，結(jié)果顯示相對(duì)于牛

11、血清白蛋白(Albumin frombovine serum，BSA)對(duì)照組，給予rA2（0.75 mg/kg-1.5 mg/kg）能有效地降低血管的滲漏。更重要的是，即使在CCI手術(shù)后6小時(shí)給予rA2（1 mg/kg）也能有效地降低血管的滲漏。同時(shí)，CCI手術(shù)后1小時(shí)給予rA2（1 mg/kg）的治療能有效地增加緊密連接蛋白:ZO-1和粘附連接蛋白:VE-cadherin的表達(dá)。以上均證明了重組膜聯(lián)蛋白A2能夠有效的逆轉(zhuǎn)腦外傷造成的血

12、腦屏障功能失調(diào)，并且增加連接復(fù)合體的蛋白表達(dá)水平。
　　在體外試驗(yàn)中，使用小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）中膜聯(lián)蛋白A2表達(dá)沉默，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間的滲透性顯著高于對(duì)照組。在單層緊密的HBMEC中加入炎癥分子白介素-1β(Interlukin1β，IL-1β)，細(xì)胞的滲透性顯著增

13、加，而rA2可以逆轉(zhuǎn)這種損傷。進(jìn)一步，創(chuàng)傷性腦外傷在體外模擬模型:IL-1β+缺氧混合模型能明顯增加HBMEC的滲透性，而rA2也能逆轉(zhuǎn)這種損傷。提取HBMEC的細(xì)胞膜蛋白，并對(duì)連接復(fù)合體的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。IL-1β+缺氧能降低所有連接復(fù)合體蛋白的表達(dá)，而給予rA2后，能顯著增加ZO-1和VE-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)表明，rA2通過(guò)影響ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)以及在細(xì)胞中的分布來(lái)保護(hù)IL-1β+缺氧造成

14、的血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透增加。
　　3.膜聯(lián)蛋白A2對(duì)創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護(hù)作用機(jī)制
　　提取人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜蛋白，使用膜聯(lián)蛋白A2的特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）。結(jié)果顯示膜聯(lián)蛋白A2能夠和細(xì)胞膜上粘附連接蛋白VE-cadherin以及細(xì)胞骨架蛋白F-actin相互結(jié)合。IL-1β+缺氧能夠減少膜聯(lián)蛋白A2在HBMEC胞膜上的分布，而給予rA2后，細(xì)胞膜上膜聯(lián)蛋

15、白A2的量明顯增加。這也導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白A2和VE-cadherin、F-actin的相互作用增加，進(jìn)而穩(wěn)定VE-cadhefin和F-actin在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的分布，增加細(xì)胞的緊密連接性。
　　IL-1β+缺氧明顯激活了小G蛋白酶ARF6，而rA2能夠抑制ARF6的激活。利用siRNA沉默內(nèi)源性膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的ARF6被明顯激活。使用ARF6的特異性激活劑QS11能降低連接復(fù)合體的表達(dá)水平，而rA2能夠逆轉(zhuǎn)ZO-1

16、和 VE-cadherin的減少。使用ARF6的特異性抑制劑SecinH3，能夠抑制IL-1β+缺氧造成的ZO-1和VE-cadherin在細(xì)胞膜上表達(dá)的降低，而rA2的作用并沒(méi)有強(qiáng)于SecinH3+rA2組保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)表明:rA2調(diào)控血腦屏障連接復(fù)合體的表達(dá)主要依賴(lài)于ARF6通路。
　　研究結(jié)論：
　　膜聯(lián)蛋白A2參與血腦屏障功能的形成和成熟，膜聯(lián)蛋白A2的缺失使胚胎期血腦屏障出現(xiàn)損傷，并且該損傷能伴隨至成年。在生理

17、情況造成小分子的滲漏，也會(huì)加重創(chuàng)傷性腦外傷導(dǎo)致的血腦屏障損傷。外源給予重組的膜聯(lián)蛋白A2能夠保護(hù)創(chuàng)傷性腦外傷造成的血腦屏障滲漏，避免二次損傷的發(fā)生。膜聯(lián)蛋白A2能通過(guò)和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的粘附連接蛋白VE-cadherin、細(xì)胞骨架蛋白F-actin相互作用，穩(wěn)定它們?cè)谀ど系姆植?。同時(shí)，外源性給予重組膜聯(lián)蛋白A2能抑制ARF6分子的活化從而增加連接復(fù)合體在膜上的表達(dá)，增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接性。該研究不僅拓展了膜聯(lián)蛋白A2的功能以