家蠶類免疫球蛋白Hemolin的初步研究.pdf

1、Hemolin蛋白是昆蟲先天性免疫蛋白中重要的成員，目前只有在鱗翅目昆蟲體內(nèi)存在。家蠶（Bombyx mori）由于其研究較多，遺傳材料豐富，背景清楚，方便飼養(yǎng)等眾多優(yōu)點(diǎn)而成為鱗翅目昆蟲中的代表種，是研究免疫和變態(tài)發(fā)育的適宜材料，我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象就是家蠶的Henolin蛋白。
　　目前認(rèn)為Hemolin蛋白參與了鱗翅目昆蟲的免疫和發(fā)育過程，但對(duì)其功能的本質(zhì)卻仍有很多不清楚的地方。許多研究已經(jīng)鑒定出hemolin能夠在幼蟲的脂肪體、中

2、腸、血淋巴和外表皮組織中低水平的轉(zhuǎn)錄。hemolin基因能夠受到細(xì)菌的誘導(dǎo)表達(dá)，且誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平很高。也有實(shí)驗(yàn)指出，在某些鱗翅目昆蟲中hemolin基因也能夠受到病毒的誘導(dǎo)，可能具有抵御病毒入侵的作用。還有些研究發(fā)現(xiàn)，在某些鱗翅目的卵巢組織、卵和蛹中也檢測(cè)到了hemolin基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，這暗示hemolin也可能參與昆蟲的發(fā)育調(diào)節(jié)。
　　就目前來說，關(guān)于hemolin的研究大多局限于惜古比天蠶（Hyalophra cecro

3、pia）和煙草天蛾（Maduca sexta）這些昆蟲中，而很少有研究家蠶hemolin基因。本實(shí)驗(yàn)利用qPCR和Western Blotting等方法研究了大腸桿菌和家蠶核型多角體病毒侵染對(duì)家蠶中腸hemolin的轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響。研究了細(xì)菌細(xì)胞壁成分肽聚糖和脂多糖對(duì)家蠶hemolin基因的影響。通過二維電泳的方法研究了家蠶經(jīng)細(xì)菌刺激后中腸組織和血淋巴蛋白質(zhì)組的變化。通過對(duì)家蠶蛹注射siRNA片段，將hemolin基因沉默，觀察家蠶蛹

4、發(fā)育變化，證明hemolin基因與家蠶的發(fā)育有關(guān)。
　　(1)抗體是研究蛋白及蛋白互作的重要工具之一。我們利用小鼠制備了Hemolin蛋白的多克隆抗血清用于檢測(cè)Hemolin蛋白的表達(dá)情況。免疫印跡結(jié)果顯示，在家蠶中能夠特異性地檢測(cè)Hemolin蛋白。利用該抗體我們還從蛹中純化出Hemolin蛋白。
　　(2)通過RT-PCR得到了家蠶中腸組織hemolin基因的cDNA序列。家蠶五齡第三天分別注射滅活的大腸桿菌和家蠶核型多

5、角體病毒，在病原物侵染后9小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后分別取中腸組織提取mRNA和蛋白，用于qPCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌能夠有效誘導(dǎo)家蠶中腸hemolin基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上和對(duì)照組（注射PBS）相比大約提高26倍。但是在注射BmNPV病毒后，不管在RNA水平還是在蛋白水平上都不能檢測(cè)到Hemolin蛋白的變化。
　　(3)為研究細(xì)菌細(xì)胞壁成分肽聚糖和脂多糖能否誘導(dǎo)家蠶中腸hemo

6、lin基因的表達(dá)，通過注射外源肽聚糖和脂多糖溶液來刺激家蠶，并利用qPCR和Western Blotting方法檢驗(yàn)其對(duì)hemolin的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肽聚糖和脂多糖都能夠誘導(dǎo)家蠶中腸組織hemolin基因的表達(dá)，分別約為對(duì)照組的7.95倍和7.62倍，但是沒有滅活的大腸桿菌的刺激效果顯著。
　　(4)家蠶中腸組織和血淋巴受到細(xì)菌侵染后，體內(nèi)的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，許多蛋白的表達(dá)受到了激活或者抑制，我們利用二維電泳的方法來探尋在家

7、蠶受到滅活的大腸桿菌刺激后，中腸和血淋巴蛋白質(zhì)組的變化，以期發(fā)現(xiàn)與Hemolin蛋白相關(guān)的蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在家蠶中腸組織中，在感染9小時(shí)后與對(duì)照相比能夠檢測(cè)7個(gè)差異蛋白，我們對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，解析了其中的3種蛋白，他們分別是葡萄糖苷酶前體、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和液泡ATP合成酶亞基。在家蠶血淋巴中，有3個(gè)差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)是家蠶預(yù)測(cè)蛋白，功能還未知;其余兩個(gè)是30K蛋白。
　　(5)RNA干擾是研究某個(gè)

8、基因功能常用的方法之一。我們將合成的三種siRNA片段導(dǎo)入到蠶蛹翅原基附近，通過檢測(cè)蛹期家蠶hemolin表達(dá)的變化和蠶蛹孵化成成蟲后的形態(tài)變化，探尋家蠶hemolin基因與家蠶翅原基發(fā)育是否相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的siRNA注射后，會(huì)引起家蠶蠶蛹的死亡。中、低濃度的siRNA注射后，家蠶也能夠孵化成成蟲。當(dāng)注射siRNA片段量為2μg時(shí)，在mRNA水平和蛋白水平上都沒有檢測(cè)到hemolin表達(dá)量的明顯變化，成蟲的翅膀也發(fā)育完全。當(dāng)