體液免疫球蛋白測定

1、第十六章 體液免疫球蛋白測定P188,湖南省中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫教研室 李志芳,抗體（antibody,Ab)：是B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合球蛋白。(生物學(xué)功能上的概念)抗體主要存在于血清等體液中，故將抗體介導(dǎo)的免疫稱為體液免疫。,幾個概念,免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）：具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。（化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念）,Ab與Ig的聯(lián)系 1. 所有的Ab

2、都是Ig 2. Ig并非都是Ab,分泌型（secreted Ig，sIg）：存在于血清等體液中，如Ab膜型（membrane Ig，mIg）是B細(xì)胞上的抗原受體。,,Ig的基本結(jié)構(gòu)：四肽鏈結(jié)構(gòu),所有Ig的基本單位都是四條肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)。兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）。每條重鏈和輕鏈分為氨基端和羧基端。,免疫球蛋白分類及特性,重鏈性質(zhì)，Ig分5類：IgG(γ)、IgA(α)、IgM(μ)、

3、 IgD(δ)、IgE(ε)輕鏈性質(zhì)，Ig分2型：κ、λIg占血漿蛋白總量：20%Ig含量：血清 IgG、IgA、IgM：g/L、 IgD、IgE：mg/L 體液 IgG、IgA、IgM：mg/L 檢測意義：反應(yīng)機(jī)體的免疫功能、診斷疾病,五類免疫球蛋白的特點(diǎn)和功能,第一節(jié) 體液中IgG、IgA、IgM 測定的臨床應(yīng)用,體液免疫球蛋白測定主要指對人體的血液、尿液、腦脊液等樣本中的Ig

4、G、IgA、IgM 定量檢測，由于免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 在人體體液中含量相對較高，測定快速，臨床意義明確，臨床應(yīng)用較廣泛,IgG是血清中含量最高(占80%)的免疫球蛋白，是血液和細(xì)胞外液中的主要抗體，也是機(jī)體再次免疫的主要抗體。 IgA分為血清型A1和分泌型A2，是參與黏膜局部免疫的主要抗體，主要存在于胃腸道和支氣管分泌液、初乳、唾液和淚液中。 IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是個體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體，也是抗

5、原刺激誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體。,測定方法 單向環(huán)狀免疫擴(kuò)散法(耗時、重復(fù)性差) 免疫濁度法（速率散射比濁）常用,,年齡：血液Ig隨年齡、性別、血型、種族及測定方法不同有所差別，各實(shí)驗(yàn)室要建立自己的參考范圍,一、血液免疫球蛋白測定的臨床意義,高Ig血癥 多克隆Ig增高（感染） 單克隆Ig增高（免疫增殖?。┑虸g血癥: 先天性低Ig血癥（免

6、疫缺陷?。?獲得性低Ig血癥(蛋白丟失、淋巴系統(tǒng)腫瘤、使用免疫抑制劑),,,正常人尿液中的Ig含量甚微，當(dāng)機(jī)體的免疫功能異?；蜓装Y反應(yīng)引起腎臟疾病時，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜分子屏障破壞或電荷屏障受損，從而引起球蛋白及其他大分子蛋白質(zhì)漏出增多。,二、尿液免疫球蛋白測定的臨床意義,,判斷腎小球?yàn)V膜受損程度：選擇性蛋白尿指數(shù)SPI可根據(jù)尿內(nèi)Ig增高的類型幫助鑒別診斷腎小球疾病的種類尿中游離輕鏈的檢測對診斷輕鏈病和MM有重要意

7、義,三、腦脊液免疫球蛋白測定的臨床意義,生理情況下，Ig根據(jù)其分子量大小，通過血腦屏障的難易度不同，IgG、IgA、IgM在腦脊液中的濃度遞減。病理狀態(tài)時，血腦屏障通透性增加，腦脊液組分發(fā)生改變。,血腦屏障受損程度：白蛋白商值、CSF-IgG指數(shù)增高有臨床意義：多發(fā)性硬化癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,第二節(jié)血液IgD和IgE的測定及臨床應(yīng)用,正常人血液中IgD含量很低（0.2%），目前生物學(xué)功能尚不清楚IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋

8、白，主要由黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌，為親細(xì)胞抗體，引起I型超敏反應(yīng)；與機(jī)體抗寄生蟲免疫也可能有關(guān)。,一、IgD的測定及臨床意義,測定方法：放免、免疫比濁、ELISA(常用)臨床意義：血液中含量波動范圍大，各實(shí)驗(yàn)室最好使用固定的試劑盒，建立自己的參考范圍,二、IgE的測定及臨床意義,測定方法： 總IgE測定：放射免疫分析法 化學(xué)發(fā)光免疫分析法(常用) 免疫比濁法

9、 酶聯(lián)免疫吸附法(常用) 特異性IgE測定：免疫斑點(diǎn)法 酶聯(lián)免疫吸附法臨床意義： 增高：變態(tài)反應(yīng)性疾病、寄生蟲感染、病毒感染、自身免疫性疾病。 降低：意義不大,第三節(jié) 血清IgG亞類測定及臨床意義,Ig亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，其含量依次下降測定方法： 單向免疫擴(kuò)散法 免疫比濁法（常用） 放射免疫分析法 酶聯(lián)

10、免疫吸附法（常用）臨床意義：IgG亞類可能和感染復(fù)發(fā)、免疫缺陷和自身免疫性疾病有關(guān)，因而測定IgG亞類對上述疾病有重要意義。即使當(dāng)總IgG水平在正常范圍內(nèi)，IgG的亞類分配也可能發(fā)生紊亂,第四節(jié) M蛋白測定及臨床意義,M蛋白： B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞單克隆異常增殖產(chǎn)生的一種在氨基酸組成及順序上十分均一的異常單克隆免疫球蛋白 臨床上多見于多發(fā)性骨髓瘤、高丙種球蛋白血癥、惡性淋巴瘤、重鏈病、輕鏈病等,M蛋白測定,蛋白區(qū)帶電泳：經(jīng)典方

11、法 計算蛋白含量和百分比免疫比濁法： 免疫球蛋白定量 準(zhǔn)確性高、快速免疫電泳： M蛋白分型免疫固定電泳： M蛋白分型及鑒定，分辨 率高(最常用),各方法視具體情況合理選用,蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳是血清蛋白的經(jīng)典分析方法，血清（或尿液）標(biāo)本中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)由于其等電點(diǎn)，分子量和分子形狀各不相同，其電泳速度就不同，可明顯分開形成不同的區(qū)帶，與正常

12、的電泳圖譜進(jìn)行比較，很容易發(fā)現(xiàn)患者電泳圖譜中不一樣的狹窄而濃縮的集中帶，即M區(qū)帶。這是由于M蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度均一，因而其電泳遷移率十分一致。如果將這些區(qū)帶電泳圖譜掃描，還可計算出異常蛋白的含量和百分比。這種M區(qū)帶較多見于γ或β區(qū)，偶亦可見于α區(qū)。該法方便，是篩選M蛋白的最基本方法。但是區(qū)帶電泳不能判定免疫球蛋白的類型，最終還需用特異性抗體進(jìn)行鑒定。,一、血清蛋白區(qū)帶電泳,血清蛋白電泳,正常的電泳圖譜,出現(xiàn)在β區(qū)域的單克隆免疫球蛋白

13、,,出現(xiàn)在γ區(qū)域單克隆免疫球蛋白,二、血清免疫球蛋白定量測定,血清免疫球蛋白定量測定也可作為檢測M蛋白的初篩試驗(yàn)。免疫球蛋白定量測定較常用的方法有單向擴(kuò)散法與免疫濁度法，前者較為簡便，后者更為準(zhǔn)確迅速 免疫球蛋白定量檢測，有助于丙種球蛋白病的診斷，并對丙種球蛋白病的良、惡性鑒別有幫助。惡性單克隆丙種球蛋白病常呈現(xiàn)某一類丙種球蛋白的顯著增高，大多在30g/l以上；在良性丙種球蛋白病的血清標(biāo)本中，M蛋白多在20g/l以下,三、免疫電泳（常

14、規(guī)方法）,疑為丙種球蛋白病的患者，經(jīng)血清蛋白區(qū)帶電泳和免疫球蛋白測定，已基本證實(shí)是否有免疫球蛋白的異常增高和其含量的多少，但是增高的M蛋白究竟是哪一類免疫球蛋白，仍需進(jìn)一步分類鑒定，常應(yīng)用各種類型的特異性抗血清，做不同形式的電泳或免疫擴(kuò)散。免疫電泳是將區(qū)帶電泳和免疫擴(kuò)散結(jié)合起來的一種免疫學(xué)分析法。 一般多用抗IgG、IgM、IgA、κ和λ輕鏈等5種抗血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用抗正常人血清作為對照。M蛋白與相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)所出現(xiàn)的沉淀弧較為特殊

15、，較普通沉淀弧寬，凸出呈弓形，不難辨認(rèn),免疫電泳示意圖,四、免疫固定電泳（最常用）,區(qū)帶電泳+沉淀反應(yīng)：將待測血清或其他標(biāo)本在瓊脂平板上作區(qū)帶電泳，分離后于其上覆蓋含抗κ或λ輕鏈或各類重鏈的抗血清濾紙，當(dāng)抗體與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合后，便形成復(fù)合物而沉淀下來，再通過漂洗與染色，呈現(xiàn)濃而狹窄的著色區(qū)帶，即可判斷單克隆丙種球蛋白的輕鏈和重鏈型別結(jié)合蛋白質(zhì)電泳的高分辨率和抗原抗體反應(yīng)的特異性測定時間短(1.5-2h)、敏感性高（0

16、.5-1.5g/l）、結(jié)果直觀易于分析判斷,,,,,左圖為IgG κ型, 中圖為IgG λ型，右為正常,,,,,免疫固定電泳示意圖,五、本-周蛋白的檢測,本周蛋白即尿中游離的免疫球蛋白輕鏈，其檢測對輕鏈病的診斷是必不可少的項目，并對多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白病、重鏈病等疾病的診斷、鑒別和預(yù)后判斷均有一定幫助 加熱沉淀法:本周蛋白在pH5.0的條件下，加熱至50℃～60℃時出現(xiàn)沉淀，繼續(xù)加熱至90℃后又重新溶解。根據(jù)這種理化性質(zhì)，又將

17、其稱為凝溶蛋白，故可根據(jù)這一特點(diǎn)，用化學(xué)方法進(jìn)行檢測。這種方法簡便易行，但敏感度較低，也不能確定輕鏈的型別 免疫電泳分析法：尿標(biāo)本用抗κ和λ型輕鏈抗血清進(jìn)行免疫電泳分析，游離輕鏈往往與其中一型的抗血清起反應(yīng)，在β-γ區(qū)附近形成一條致密的弓形沉淀弧。,六、κ-Ig和λ-Ig定量測定,樣本：尿液、血液 方法：單向免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法（常用，準(zhǔn)確、快速）應(yīng)用：M蛋白血癥的分型及鑒定多數(shù)實(shí)驗(yàn)室確立的κ/λ比率正常范圍在1.2-2.4

18、，通過κ/λ比率測定有助于判斷疾病類型和監(jiān)測治療效果,冷球蛋白是血清中的一種特殊蛋白質(zhì)，在4℃時自發(fā)沉淀，在37℃時又可溶解 ，常利用這種可逆性冷沉淀的特性對其進(jìn)行測定。取患者外周血，分離出血清置4℃冰箱中，一般在24～72h出現(xiàn)沉淀，若1周仍不出現(xiàn)沉淀者方可判斷為陰性。如形成沉淀，再置37℃溫育使其復(fù)溶，也可將冷沉淀物離心洗滌后做定性與定量分析。,七、 冷球蛋白的檢測,冷球蛋白的類型及臨床意義 I型：為單克隆冷球蛋白型，占25%