家蠶脂蛋白BmLp-c21的研究.pdf

1、脂蛋白即載脂蛋白和脂質(zhì)結(jié)合的復(fù)合蛋白,表層含蛋白質(zhì)(載脂蛋白)和極性脂質(zhì)(磷脂和未脂化的膽固醇),核心含甘油三酯和膽固醇酯。我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選得到一條脂蛋白的cDNA序列,其全長為2803bp,ORF框?yàn)?92bp,編碼263個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)該蛋白的分子量為30.24kD,等電點(diǎn)為7.23,將其命名為BmLp-c21。根據(jù)cDNA序列的ORF框設(shè)計(jì)上下游引物,PCR擴(kuò)增目的基因ORF框,插入表達(dá)載體pET-2

2、8a(+),成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒oET-28a(+)-BmLp-c21并轉(zhuǎn)化大腸菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析,在34kD左右的位置有特異性蛋白條帶,與預(yù)測(cè)值(融合His標(biāo)簽3.56kD,BmLp-c2130.24kD)相符,融合蛋白以包涵體的形式存在。將包涵體洗滌,溶解處理后,經(jīng)Ni-NTA柱親和層析得到純化的融合蛋白。用該融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,ELISA檢測(cè)效

3、價(jià)在1:6400以上。
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對(duì)BmLp-c21在家蠶不同發(fā)育時(shí)期、五齡幼蟲不同組織中的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。BmLp-c21基因在家蠶四個(gè)發(fā)育時(shí)期中的轉(zhuǎn)錄水平由高到低依次為蛹、五齡幼蟲、蛾及卵。BmLp-c21基因在家蠶五齡幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄由高到低依次為血液、脂肪體、氣管、精巢、卵巢、中腸、絲腺、頭部、馬氏管及表皮。提取家蠶卵、五齡幼蟲、蛹和蛾四個(gè)時(shí)期及五齡幼蟲的頭部、血液、絲腺等各組織的