家蠶脂蛋白pBmHPC-23的研究.pdf

1、脂蛋白(lipoprotein)是富含脂質(zhì)的顆粒，表層含蛋白質(zhì)(載脂蛋白)和極性脂質(zhì)(磷脂和未脂化的膽固醇)，其非極化脂質(zhì)核心含甘油三酯和膽固醇酯。各種脂蛋白所含脂類和蛋白質(zhì)的量各不相同，其密度亦各不相同，經(jīng)密度梯度離心，脂蛋白可分為四類：乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。CM內(nèi)所含膽固醇(CH)很少，是外源性脂肪的主要運(yùn)輸形式。VLDL膽固醇的含量也較少，它是內(nèi)源性脂肪的主要

2、運(yùn)輸形式。LDL含量較少，但膽固醇和磷脂的含量較高，是將肝臟合成的內(nèi)源性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至周圍的主要形式，并調(diào)節(jié)膽固醇的合成。HDL是肝臟合成的密度較高、顆粒較小的脂蛋白，其包含的脂質(zhì)主要是磷脂、CH、膽固醇酯和TG。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中，我們發(fā)現(xiàn)了四條編碼家蠶載脂蛋白的cDNA序列。其中一條，通過(guò)NCBI里的blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它含有917個(gè)堿基，其ORF為786個(gè)堿基，是一個(gè)完整的編碼框，編碼261個(gè)氨基酸，預(yù)

3、測(cè)該蛋白的分子量為30.013kDa，等電點(diǎn)為7.193。其命名為Bomby.mor.lipoprotei.pBmHPC-23(BmLp-c23)，GenBank登錄號(hào)為EU024295。將PCR擴(kuò)增所得目的基因完整的ORF，經(jīng)Ba.HI和Hin.III雙酶切后，插入融合表達(dá)載體pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，成功構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a.BmLp-c23，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及

4、測(cè)序分析證實(shí)重組成功。
　　 將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為.mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在33kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期值(融合標(biāo)簽3.5.kDa，BmLp-c2.30，01.kDa)相符。但是融合蛋白以包涵體的形式存在。將包涵體洗滌，溶解處理后，發(fā)現(xiàn)難溶于包涵體溶解液中。但是，發(fā)現(xiàn)一個(gè)很重要的現(xiàn)象，雖然目的蛋白無(wú)法溶解于此溶解液中，而菌體的那些雜蛋白卻可

5、以有一定的溶解。按此思路純化融合蛋白。將包涵體反復(fù)用此溶解液溶解，以去除雜蛋白。融合蛋白純化后的純度約為90％。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備了該重組蛋白的多克隆抗體，用ProteinA凝膠柱純化多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià)可達(dá)到1：8000以上。提取家蠶五齡幼蟲(chóng)的各組織蛋白，用于Wester.blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmLp-c23蛋白在家蠶的性腺、氣管、馬氏管、表皮、脂肪體組織中都有表達(dá)，而在絲腺