家蠶BmAGO2蛋白結(jié)合RNA的研究.pdf

1、Argonaute(AGO)蛋白免疫沉淀法分離和鑒定miRNA靶基因已成為miRNA靶基因的規(guī)?；b定的重要方法。AGO蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)的核心催化元件，能夠與小RNA結(jié)合并且在小RNA的指導(dǎo)下結(jié)合靶基因，進一步剪切或抑制靶基因的表達。前期研究我們通過免疫共沉淀方法分離了BmAGO2結(jié)合RNA中50nt以下的小RNA，高通量測序獲得大量不同類型的小RNA，包括m

2、iRNA、piRNA、TE-siRNA和未注釋小RNA等。這些小RNA可能通過結(jié)合BmAGO2蛋白形成類似miRISC復(fù)合體后結(jié)合靶基因mRNA。因此，本研究通過免疫共沉淀和高通量測序方法解析和鑒定了BmAGO2結(jié)合的小RNA潛在靶基因mRNA，為家蠶中BmAGO2結(jié)合的小RNA功能研究打下基礎(chǔ)。
　　利用重組病毒iel-vbacmid-BmAGO2感染BmN細胞表達BmAGO2蛋白后，通過免疫共沉淀方法分離BmAGO2及其結(jié)合的

3、RNA。將長度大于200nt的RNA進行高通量測序，測序共獲得11，528，900條reads。進一步分析高通量測序結(jié)果獲得BmAGO2蛋白結(jié)合RNA中mRNA有851條，轉(zhuǎn)座子(Transposableelements，TEs)有1，694條。BmAGO2蛋白結(jié)合mRNA的GO富集性分析結(jié)果顯示，這些mRNA主要參與家蠶細胞的結(jié)構(gòu)組成和細胞發(fā)育，分化過程?；贐mAGO2結(jié)合的miRNA和mRNA，通過miRanda和RNAhybri

4、d軟件進行了miRNA靶標分析，預(yù)測了大量miRNA靶基因的結(jié)合位點，進一步證實一個miRNA對應(yīng)多個靶mRNA，同時一個mRNA也可能受多個miRNA調(diào)控的miRNA調(diào)控通路的特征。對BmAGO2蛋白結(jié)合未注釋的siRNA和其潛在的降解靶基因mRNA的研究發(fā)現(xiàn)，共有115條BmAGO2結(jié)合的mRNA存在匹配的BmAGO2結(jié)合siRNA，表明侵染桿狀病毒的家蠶mRNA的基因表達可能受siRNA通路的調(diào)控
　　BmAGO2結(jié)合小RN

5、A中存在大量TE來源小RNA，將BmAGO2結(jié)合的豐度大于等于50的TEs與這些TE-siRNA進行匹配對比，發(fā)現(xiàn)其中有112條TEs能找到其匹配的BmAGO2結(jié)合小RNA，且這些小RNA與匹配TE反向互補，推測這些小RNA可能通過與BmAGO2蛋白結(jié)合形成RISC來抑制轉(zhuǎn)座子的表達水平，調(diào)控轉(zhuǎn)座子的活性，進一步維持基因組的穩(wěn)定性。BmAGO2結(jié)合的bm1645轉(zhuǎn)座子豐度遠遠大于其它結(jié)合的TEs，而且其來源的小RNA豐度也遠遠大于其它T

6、Es來源的小RNA，表明bm1645轉(zhuǎn)座子是TE來源小RNA的“生產(chǎn)基地”。bm1645產(chǎn)生小RNA的區(qū)域并不是隨機分布，而是分布在5個主要的區(qū)域。其具體功能機制還有待進一步研究。
　　我們隨機選擇了5個表達豐度較高的TEs:Aquila，BmpiggyBac-MER85，bm1456，bm1645和bm1866。利用重組質(zhì)粒pIEx-1-BmAGO2在BmN細胞中過表達BmAGO2蛋白，經(jīng)過qRT-PCR檢測顯示，Aquila和

7、bm1456的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，BmpiggyBac-MER85，bm1645和bm1866下調(diào)。同時，通過RNAi的方法分別下調(diào)BmN細胞中BmAGO2，BmAGO3和BmSIWI轉(zhuǎn)錄水平，經(jīng)過qRT-PCR檢測顯示，5個TEs的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的上調(diào)。AGO蛋白作為RISC的關(guān)鍵組分，其表達量的降低會影響RISC活性。進一步證實BmAGO2可能通過與TE-siRNA結(jié)合，形成類似RISC的復(fù)合體，從而調(diào)控TEs的活性。而BmAGO3