冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理研究.pdf

1、亞低溫（32℃）是一種有效的、在臨床工作中常用的腦保護(hù)治療措施。然而其確切的治療機(jī)制目前仍未完全了解。由于其明顯的副作用，如：易誘發(fā)低血壓、低血容量、心率過(guò)緩、電解質(zhì)紊亂及高血糖，常常會(huì)影響患者預(yù)后。尋找一種既可以發(fā)揮亞低溫腦保護(hù)作用，又能避免繼發(fā)性損害的有效治療途徑并能明確其機(jī)制，是本項(xiàng)研究的主要目的。
　　前期研究已證實(shí)，亞低溫時(shí)動(dòng)物腦內(nèi)冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold-inducibleRNAbindingprotein，CI

2、RP）的表達(dá)量明顯增加；CIRP能與硫氧還蛋白(TRX)mRNAs的3′-UTR直接作用，促進(jìn)TRX合成增加，清除受損組織內(nèi)的氧自由基而對(duì)組織起到保護(hù)作用。CIRP是否參與了亞低溫腦保護(hù)過(guò)程，至今尚無(wú)明確答案。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了神經(jīng)元體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，用以觀察神經(jīng)元經(jīng)H2O2、亞低溫、CIRP-RNAi慢病毒或空病毒轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)條件處理后，檢測(cè)CIRP、TRX及細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Activedcaspase-3的含量變化，并探討了它們之間可能存在

3、的相互關(guān)系。結(jié)果提示CIRP在亞低溫時(shí)被誘導(dǎo)高表達(dá)，直接或間接通過(guò)降低氧自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷、抑制凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)從而減少神經(jīng)元凋亡進(jìn)而起到神經(jīng)元保護(hù)作用。
　　目的：探討CIRP是否通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮亞低溫腦保護(hù)作用。
　　方法：分離培養(yǎng)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，第五天用CIRP-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，第8天用100μmol/LH2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡后，隨機(jī)分為四組：1、常溫對(duì)照組（37℃）；2、亞低溫對(duì)照組（32℃

4、）；3、CIRP慢病毒感染組（加入CIRP-RNAi慢病毒）；4、空病毒感染組。將后三組移入32℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；應(yīng)用Hoechst33342染色、AnnexinV-FITC標(biāo)記法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組神經(jīng)元的凋亡率；Westernblot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞CIRP、Activedcaspase-3及TRX蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：常溫對(duì)照組CIRP表達(dá)較低，而在亞低溫各組中，對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)，

5、加入CIRP-RNAi慢病毒明顯抑制CIRP的表達(dá)，而空病毒組CIRP表達(dá)與亞低溫對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。hoechst33342細(xì)胞核染色，常溫對(duì)照組可見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡；而在亞低溫環(huán)境下，對(duì)照組神經(jīng)元凋亡明顯減少；當(dāng)加入CIRP-RNAi慢病毒抑制CIRP的表達(dá)后，神經(jīng)元凋亡顯著；空病毒組并不影響CIRP的表達(dá)，亦可見(jiàn)凋亡明顯改善。利用AnnexinV-FITC標(biāo)記法定量檢測(cè)各組神經(jīng)元的凋亡率，常溫對(duì)照組的神經(jīng)元凋亡率為(53.5±1.

6、7)%；而在亞低溫環(huán)境下，對(duì)照組神經(jīng)元凋亡率為(4.5±0.8)%，與常溫對(duì)照組相比有顯著差異（p<0.05）；當(dāng)加入CIRP-RNAi慢病毒抑制CIRP的表達(dá)后，神經(jīng)元凋亡率為(49.2±2.1)%，與常溫對(duì)照組相比無(wú)明顯差異；空病毒組并不影響CIRP的表達(dá)，其凋亡率為(7.5±1.2)%,與常溫對(duì)照組相比亦存在顯著差異（p<0.05）。常溫對(duì)照組中，由于H2O2對(duì)細(xì)胞的毒性作用，神經(jīng)元凋亡明顯，Activedcaspase-3表達(dá)明

7、顯增高；而在亞低溫狀態(tài)下，對(duì)照組中Activedcaspase-3表達(dá)下調(diào)，加入CIRP-RNAi慢病毒后，Activedcaspase-3表達(dá)增加；而空病毒組CIRP表達(dá)與低溫對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。常溫對(duì)照組TRX表達(dá)較低，而在亞低溫各組中，對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)，加入CIRP-RNAi慢病毒明顯抑制TRX的表達(dá)；而空病毒組TRX的表達(dá)與低溫對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：亞低溫能誘導(dǎo)CIRP蛋白在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達(dá)增高；亞低溫