牙鲆(Paralichthys olivaceus)冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)基因克隆、表達(dá)分析及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).pdf

1、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)是富含甘氨酸(Gly)的RNA結(jié)合蛋白家族成員之一,是一類(lèi)重要的mRNA分子伴侶蛋白。冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白是第一個(gè)從哺乳動(dòng)物中分離得到的冷休克蛋白。該蛋白在冷休克或冷誘導(dǎo)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞具有重要的生理作用。自從冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白基因在哺乳動(dòng)物中被克隆得到以后,學(xué)者們?cè)诓溉閯?dòng)物和兩棲類(lèi)中對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究。隨著研究的深入,研究結(jié)果表明該蛋

2、白在許多生理過(guò)程中起重要作用。例如,冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白對(duì)兩棲類(lèi)的冬眠、生物節(jié)律性周期的維持以及正常胚胎發(fā)育均具有重要作用。目前,關(guān)于冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白對(duì)魚(yú)類(lèi)正常條件下的生理及脅迫條件下的相關(guān)作用研究相對(duì)較少。對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)相關(guān)EST-SSRs標(biāo)記的分析及大菱鲆性別相關(guān)基因研究分別發(fā)現(xiàn)冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白與生長(zhǎng)和性別相關(guān)。因此,本研究中對(duì)牙鲆冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,并初步探索其表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其發(fā)揮功能的機(jī)制。
　

3、　本研究中,首先通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)克隆得到牙鲆CIRP基因cDNA全長(zhǎng)序列。該基因cDNA全長(zhǎng)1596bp,其中ORF長(zhǎng)597bp,編碼的蛋白由198個(gè)氨基酸殘基組成。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白序列N端包含RRM結(jié)構(gòu)域,C端富含甘氨酸(Gly)并且存在Arg-Gly-Gly(RGG)重復(fù)序列。
　　通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了牙鲆CIRP基因全長(zhǎng)序列。通過(guò)分析可知,該基因包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,并且所有的內(nèi)含子均符合GT-AG規(guī)則。利用染

4、色體步移法克隆得到了4K長(zhǎng)的該基因的5'側(cè)翼序列,并在啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出了許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。除了HSF、SRY等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)外,在外顯子1區(qū)域附近預(yù)測(cè)到一個(gè)CpGs位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同性別個(gè)體、不同組織該區(qū)域DNA甲基化水平研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域甲基化水平較低。
　　通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)CIRP基因在牙鲆成體各個(gè)組織中廣泛表達(dá),并且在卵巢中表達(dá)量最高,在其他組織中表達(dá)水平較低。對(duì)牙鲆不同發(fā)育時(shí)期胚胎的定量PCR分析發(fā)現(xiàn),在牙鲆

5、卵細(xì)胞中CIRP基因具有表達(dá)且表達(dá)的mRNA是母源性的。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)在囊胚期和神經(jīng)胚期間上調(diào)并且達(dá)到峰值后逐漸下降。
　　為了獲得冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白與mRNA相互作用的信息,對(duì)牙鲆CIRP蛋白的3D模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示在該蛋白分子表面具有一個(gè)裂縫結(jié)構(gòu)。這暗示了其與mRNA分子的作用機(jī)制。為了進(jìn)一步研究該蛋白與mRNA的研究機(jī)制而構(gòu)建了表達(dá)載體,為進(jìn)一步得到該蛋白奠定基礎(chǔ)。
　　總之,本研究的結(jié)果顯示