牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗遲鈍愛(ài)德華氏菌和耐高溫家系篩選.pdf

1、牙鲆（Paralichthysolivaceus）為冷溫性、底棲型海水魚(yú)類，是中國(guó)、日本和韓國(guó)等國(guó)家的重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。1992年以來(lái)，牙鲆人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，山東、河北、遼寧等地大規(guī)模開(kāi)展了牙鲆工廠化、網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,而且養(yǎng)殖區(qū)域也由北方擴(kuò)張到南方的浙江、福建、廣西等省，取得了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但是，長(zhǎng)期的近親交配和高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致牙鲆種質(zhì)退化，生長(zhǎng)變慢，抗病力下降，導(dǎo)致病害頻發(fā)，產(chǎn)量下降，給牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)

2、巨大經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的魚(yú)病治療方法主要靠使用抗生素，而抗生素的大量使用不僅會(huì)產(chǎn)生藥物殘留、耐藥性和環(huán)境污染等問(wèn)題，而且對(duì)消費(fèi)者的健康也存在潛在的影響。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)，培育抗病力提高的牙鲆新品種迫在眉睫，成為國(guó)家和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大需求。溫度對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、攝食、代謝、存活以及分布等生命過(guò)程有著直接的影響。長(zhǎng)期的進(jìn)化使魚(yú)類都有了自己的適宜溫度范圍,在這一溫度范圍內(nèi),魚(yú)類的生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)。許多研究都表明，魚(yú)類的生長(zhǎng)與溫度具有顯

3、著的相關(guān)性。有研究表明，牙鲆在水溫23℃以上攝食減少,在水溫達(dá)33℃時(shí),有的成魚(yú)只能短暫存活,南方省份的沿海水溫較北方高,即使在北方，工廠化養(yǎng)殖在夏季水溫也會(huì)達(dá)到25℃以上，需要用深井海水降低溫度，這無(wú)疑增加了養(yǎng)殖成本。因此,研究高溫對(duì)牙鲆的耐受限度及其分子機(jī)理，培育耐高溫品系以及品種，不僅可以降低養(yǎng)殖成本,也對(duì)探索南北接力養(yǎng)殖新模式具有重要的參考意義
　　為了篩選出抗遲鈍愛(ài)德華氏菌和耐高溫的牙鲆家系，本文以近幾年我們選育出的牙鲆

4、抗病和快速生長(zhǎng)家系以及從韓國(guó)引進(jìn)的選育群體為親本建立的2013年牙鲆家系56個(gè)，并對(duì)其中32個(gè)家系進(jìn)行了遲鈍愛(ài)德華氏菌人工感染實(shí)驗(yàn)。確定了遲鈍愛(ài)德華氏菌對(duì)牙鲆家系的半致死濃度LD50為3.69×105CFU/mL后，從每個(gè)家系中隨機(jī)抽取75尾，按照0.2mL/10g體重腹腔注射半致死濃度的菌液，并設(shè)置1次重復(fù)。人工感染時(shí)水溫控制在（19±1）℃。從32個(gè)家系中共選取4800尾5月齡牙鲆幼魚(yú)進(jìn)行感染，16天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各家系存活率為8.

5、2～66.1％，平均存活率為31.2%。不同家系對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌的抗感染能力表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。篩選出6個(gè)存活率高于45%的抗病家系，發(fā)現(xiàn)2007年篩選出的抗鰻弧菌病家系F0768的后代家系在遲鈍愛(ài)德華氏菌感染后的存活率普遍很高，表現(xiàn)出抗遲鈍愛(ài)德華氏菌的能力。本研究為選育抗鰻弧菌和抗遲鈍愛(ài)德華氏菌的牙鲆優(yōu)良品系奠定了基礎(chǔ)，對(duì)牙鲆抗細(xì)菌病的分子機(jī)理研究及抗病新品種選育具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值；從2012年建立的15月齡的牙鲆家系

6、中抽取21個(gè)牙鲆家系用于耐高溫實(shí)驗(yàn)，每個(gè)家系隨機(jī)抽取牙鲆各18尾，暫養(yǎng)3天待實(shí)驗(yàn)魚(yú)狀態(tài)穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。按照1.5℃/d的升溫速度升溫,達(dá)到溫度后保持溫度恒定。每2h觀察一次，記錄每個(gè)家系實(shí)驗(yàn)魚(yú)的體色變化、活動(dòng)力大小、攝食強(qiáng)弱和死亡時(shí)間等信息，及時(shí)撈出死魚(yú)，測(cè)量其全長(zhǎng)(從吻端到尾鰭末端)、體重，并剪取鰭條保存，90h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，記錄每個(gè)家系的存活數(shù)目，測(cè)量存活魚(yú)的全長(zhǎng)和體重。在32℃的高溫脅迫下，21個(gè)家系的存活率在0～47.1%之間，平

7、均存活率19.3%，其中，F(xiàn)1244、F1247、 F1210、F1242、 F1244和F1259這5個(gè)家系存活率大于35%，明顯高于其他組，將其定義為耐高溫家系，而F1255、 F1225和F1230這三個(gè)家系則全部死亡，死亡率達(dá)到了100%，將存活率小于10%的家系定義為熱敏感家系。耐高溫家系平均存活率為43.2%，而熱敏感家系只有0.041%，兩者差異極顯著（P＜0.01）。本次實(shí)驗(yàn)篩選到了5個(gè)耐高溫家系，發(fā)現(xiàn)F0719的后代家