13691.基于mariner轉(zhuǎn)座子的遲鈍愛德華氏菌突變體文庫構(gòu)建及應(yīng)用

1、分類號(hào)：Q9399密級(jí)：公開UDC：指導(dǎo)教師姓名：華東理工大學(xué)工程碩士學(xué)位論文基于mariner轉(zhuǎn)座子的遲鈍愛德華氏菌突變體文庫構(gòu)建及應(yīng)用曲江波高級(jí)工程師天源水產(chǎn)有限公司論文定稿日期：20130426工程領(lǐng)域：生物工程論文答辯日期：201306逝學(xué)位授予單位：垡丕理王太堂學(xué)位授予日期：蘭』型壘6量21丑答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱花強(qiáng)教授人：吳海珍副教授孫祥明副教授華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁基于mariner轉(zhuǎn)座子的遲鈍愛德華氏菌突變體文庫

2、構(gòu)建及應(yīng)用捅要mariner家族轉(zhuǎn)座子是一種高效、隨機(jī)的轉(zhuǎn)座元件。當(dāng)其插入到基因組上時(shí)，能突變插入位點(diǎn)的基因，快速獲得突變株，形成突變體文庫。突變體文庫在篩選細(xì)菌條件表達(dá)基因和鑒定毒力因子方面有著重要應(yīng)用。大規(guī)模序列明確的的突變體文庫包含了在基因組上突變位置明確的大量突變株，可以大大提高篩選的靶向性和準(zhǔn)確性。本研究基于mariner家族轉(zhuǎn)座子pMar2xT7，構(gòu)建了多個(gè)轉(zhuǎn)座子衍生質(zhì)粒，其中5個(gè)質(zhì)粒攜帶的不同報(bào)告基因能與基因組上啟動(dòng)子形成

3、轉(zhuǎn)錄融合。另一個(gè)衍生質(zhì)粒則含有一個(gè)向外的、受阿拉伯糖誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子PBAD，可以增強(qiáng)插入位點(diǎn)臨近基因的表達(dá)。質(zhì)粒功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明它們均能發(fā)揮預(yù)想的作用。對(duì)這些轉(zhuǎn)座子衍生體轉(zhuǎn)座效率的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子插入片段的大小與轉(zhuǎn)座效率密切相關(guān)。利用pMKGR轉(zhuǎn)座質(zhì)粒，構(gòu)建了5000多株遲鈍愛德華氏菌轉(zhuǎn)座子突變株并定位，最終得到了1098株突變位點(diǎn)明確的突變株，其中有520株為轉(zhuǎn)錄融合突變株。基因型明確的轉(zhuǎn)座子突變株構(gòu)成了Etarda的序列明確突變體文

4、庫。突變株以及文庫的各項(xiàng)指標(biāo)分析表明，轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pMKGR幾乎不存在熱點(diǎn)，具有良好的隨機(jī)性和穩(wěn)定性。Etarda的毒力基因表達(dá)受到溫度的調(diào)控，過高或過低的溫度均會(huì)導(dǎo)致三型分泌系統(tǒng)(T3SS)和六型分泌系統(tǒng)(T6SS)分泌蛋白的減少。利用轉(zhuǎn)座子文庫技術(shù)，本研究篩選到了Etarda強(qiáng)表達(dá)基因和受溫度調(diào)控基因，其中一些可能與Etarda毒力調(diào)控相關(guān)。遲鈍愛德華氏菌的PhoBPhoR雙組分系統(tǒng)和Fur分別能夠感應(yīng)磷和鐵濃度的變化，并通過EsrC及