日本牙鲆Paralichthys olivaceus核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域1基因的克隆與表征.pdf

1、日本牙鲆（Paralichthys olivaceus）是東亞國家如中國、日本和韓國沿海養(yǎng)殖中重要的魚種之一。其全球養(yǎng)殖產(chǎn)量在過去20年內(nèi)呈快速增長。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，日本牙鲆在養(yǎng)殖中面臨易受病原體感染的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，更好的了解其免疫系統(tǒng)有助于對(duì)抗其魚類疾病并促進(jìn)日本牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。
　　魚類免疫系統(tǒng)可分為先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)，也可分別稱為非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)。先天性免疫系統(tǒng)屬于整個(gè)免疫系統(tǒng)的亞系統(tǒng)

2、部分，保護(hù)機(jī)體不受其它生物的感染。它以一種籠統(tǒng)并迅速的方式識(shí)別入侵的病原體并對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答。先天性免疫對(duì)多細(xì)胞生物的生存是至關(guān)重要的，但它不能為機(jī)體提供長效的保護(hù)性免疫。獲得性免疫由高度特異性細(xì)胞，蛋白和通路組成，為機(jī)體提供長效且高度的特異性保護(hù)。先天性免疫系統(tǒng)可分為物理、細(xì)胞和體液成分。體液成分包括生長抑制因子、分解酶、天然抗體、細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽等。
　　核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域1(ENDOD1)蛋白是古老的DNA/RNA非特異

3、性核酸酶家族成員之一。該家族的核酸酶已在許多原核和真核生物中被發(fā)現(xiàn)，他們擁有以下共同特性:可切割DNA和RNA，即切割雙鏈和單鏈核酸，且反應(yīng)需要二價(jià)離子如Mg2+的參與。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，利用微陣列技術(shù)檢測了福爾馬林殺死的遲鈍愛德華氏菌(E.tarda FKC)注射不同時(shí)間段后日本牙鲆中各基因的表達(dá)情況。其中發(fā)現(xiàn)，來自日本牙鲆的ENDOD1基因(Jf_ENDOD1)在E.tarda FKC注射魚體6h及12h后，與正常魚體相比，其表達(dá)

4、量均有明顯提高。因此推測Jf_ENDOD1的表達(dá)或許與牙鲆的免疫反應(yīng)存在一定關(guān)系。
　　本研究中，利用RACE-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Jf_ENDOD1的cDNA序列。經(jīng)分析，其cDNA序列包含一個(gè)912bp的開放閱讀框，編碼303個(gè)氨基酸。起始的27個(gè)氨基酸被預(yù)測為Jf_ENDOD1的一個(gè)信號(hào)肽序列。成熟的Jf_ENDOD1由276個(gè)氨基酸組成，其預(yù)測蛋白分子量為32kDa。經(jīng)比對(duì)，日本牙鲆Jf_ENDOD1的氨基酸序列與大黃魚La

5、rimichthys crocea的預(yù)測序列相似度達(dá)76％。在Jf_ENDOD1組織分布特異性檢測中，發(fā)現(xiàn)在所有被檢測的健康魚體組織中，Jf_ENDOD1 mRNA均有少量分布，而在注射E.tarda FKC6h后的魚體組織中，Jf_ ENDOD1 mRNA在腦、腎、脾和腸組織中大量表達(dá)，在腮和皮膚組織中呈中度表達(dá)，而在肌肉和肝臟組織中未見明顯變化。
　　本研究還利用大腸桿菌Escherichia coli生產(chǎn)Jf_ENDOD1重