融合蛋白d-EGF的結(jié)構(gòu)預(yù)測、克隆、原核表達及鑒定.pdf

1、目的：對融合蛋白 d-EGF二級、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測并分析其活性部位的可能影響，進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行分析鑒定。
　　方法：以融合蛋白質(zhì)基因序列為基礎(chǔ)，用DNAStar軟件預(yù)測其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；用Insight II軟件對其三級結(jié)構(gòu)進行建模預(yù)測。在對融合蛋白理論預(yù)測的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建含β-defensin-3、EGF的重組質(zhì)粒，應(yīng)用重組PCR等方法，將EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，將

2、融合基因克隆入原核表達載體pET-SUMO,構(gòu)建目的重組質(zhì)粒 pET-SUMO-d-EGF。采用 PCR、測序等方法對目的基因是否正確重組進行鑒定；以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），以IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物經(jīng)過Ni-trap柱純化，SDS-PAGE檢測表達初產(chǎn)物及純化產(chǎn)物。最后用Western-blot對其特異性進行鑒定；用MTT法檢測其促細胞增殖活性；用紙片擴散法藥物敏感試驗、微量稀釋法檢測其抗菌活

3、性。
　　結(jié)果：采用DNAStar軟件的Gamier Robson方法預(yù)測的結(jié)果表明，融合蛋白質(zhì)d-EGF含較多的β折疊結(jié)構(gòu)；Charge Density-Charge法預(yù)測蛋白質(zhì)3-22、31-48區(qū)段帶豐富的正電荷；Insight II軟件分析顯示重組蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三級結(jié)構(gòu)中的活性必須的六個鏈內(nèi)二硫鍵在融合蛋白中都能夠正確形成，維持β-defensin-3三級結(jié)構(gòu)的3個反向平行的β折疊片

4、結(jié)構(gòu)在融合蛋白中能夠形成。融合蛋白的結(jié)構(gòu)含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性結(jié)構(gòu)。成功構(gòu)建β-defensin-3、EGF重組質(zhì)粒，經(jīng)重組PCR成功擴增出294bp的目的片段，重組體PCR結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，測序正確。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE分析得到28 kD左右的目的蛋白條帶。用Western-blot鑒定出融合蛋白含有EGF，β-防御素-3的相應(yīng)蛋白抗原表位。用

5、MTT法測得融合蛋白 d-EGF EC50約為0.4ng/ml,與EGF標準品EC500.08-0.8 ng/ml相符；用紙片擴散法藥物敏感實驗檢測對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌環(huán)出現(xiàn)，抑菌濃度25μg/ml相對標準品 hβ-defensin-3的MIC12.5μg/ml，說明d-EGF抑菌活性比標準品相對弱一些。
　　結(jié)論：在預(yù)測融合蛋白 d-EGF的二、三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建原核表達載體pET-SUMO d-EGF,并表達出純