新Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1和3D編碼基因的原核表達(dá)及抗3D蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是一種由鴨肝炎病毒(DHV)引起的急性、高度致死性傳播迅速的傳染病,病死率高達(dá)100％,是鴨的五大傳染病之一,對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重危害。自從1945年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)該病,其后世界多數(shù)國(guó)家相繼報(bào)道本病的流行。1994年,在韓國(guó)首次發(fā)現(xiàn)新型鴨肝炎病毒(DFIV-1C)。本試驗(yàn)對(duì)DHV-1CN株的編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP1基因和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的3D基因進(jìn)行原核表達(dá),并通過Western-blot檢測(cè)其免疫活性,再利用純化后的重組原

2、核表達(dá)蛋白3D作為免疫原免疫小鼠,經(jīng)過細(xì)胞融合,陽性篩選,雜交瘤細(xì)胞克隆化等步驟,成功制備1株抗DHV-1C的3D蛋白的單克隆抗體,為進(jìn)一步對(duì)DHV-1C的VP1蛋白和3D蛋白的功能的研究和建立DHV-1C的快速診斷方法奠定了基礎(chǔ),并同時(shí)建立用于篩選的間接ELISA方法。
　　 根據(jù)DHV-1C全基因序列,應(yīng)用Primer5.0分析軟件設(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增DHV-1CN毒株的VP1和3D基因的兩對(duì)引物,在VP1基因引物中加入BamHⅠ

3、和XholⅠ酶切位點(diǎn),在3D引物中加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),以DHV-1CN株RNA為模板,用這兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增VP1和3D基因,分別將VP1和3D基因克隆入pMD-18T中,經(jīng)酶切后,將帶有酶切位點(diǎn)的片段克隆入pET-30a載體中,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒BpET-30a-VP1-3和BpET-30a-3D-8,將其轉(zhuǎn)入宿主菌EcoliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和免疫印跡分析表明,重組原核表達(dá)蛋白VP1

4、和3D分別在誘導(dǎo)3h和4h后表達(dá)量達(dá)到最高,VP1表達(dá)產(chǎn)物大小約為37.68kDa,3D表達(dá)產(chǎn)物大小約為65.80kDa,Western-blot分析顯示二者都能與抗DHV-1C陽性血清產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),具有很好的免疫活性,可溶性分析顯示,二者均以不溶性的包涵體形式存在于菌體中。
　　 以純化的重組原核表達(dá)蛋白3D為免疫原腹腔皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠,并作為包被抗原建立間接免疫酶聯(lián)吸附(ELISA)方法。在加強(qiáng)免后第三

5、天,取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合,用已建立的間接EIASA方法篩選獲得1株分泌抗DHV-1C的3D蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為2D9。經(jīng)亞型鑒定,2D9的亞型為IgG1亞類,輕鏈為K鏈。經(jīng)Western-blot分析和間接ELISA檢測(cè),2D9具有很好的特異性識(shí)別抗原能力,與番鴨呼腸孤病毒σB蛋白無交叉反應(yīng),特異性良好,經(jīng)Dot-ELISA分析,2D9能夠識(shí)別天然構(gòu)象蛋白,經(jīng)免疫組化和免疫熒光檢測(cè),2D9與感染