冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白在缺氧復(fù)氧損傷中的心肌保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　探索H9c2心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)條件下冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)的表達(dá)及其在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中所起的具體作用。
　　方法:
　　(1)缺氧復(fù)氧的模型(95％N2和5%CO2)的建立,采用的是H9c2心肌細(xì)胞,在體外培養(yǎng)建成。
　　(2)檢測(cè)CIRP在缺氧/復(fù)氧過(guò)程中,mRNA及蛋白的表達(dá)概況,采用的是RT-PCR來(lái)檢測(cè)mRNA的表達(dá),

2、Western blot印跡法來(lái)檢測(cè)蛋白的表達(dá),并要著重注意兩者在缺氧/復(fù)氧過(guò)程中表達(dá)最高的時(shí)間點(diǎn),作為后續(xù)試驗(yàn)中缺氧復(fù)氧時(shí)間。
　　(3)缺氧復(fù)氧處理選擇在缺氧14h及復(fù)氧2h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)時(shí)共分為10組同時(shí)進(jìn)行,分別為:
　?、僬?duì)照組;
　　②H/R組;
　?、跜IRPsiRNA處理細(xì)胞組;
　?、蹸IRPsiRNA處理細(xì)胞+H/R組;
　　⑤陰性干擾處理細(xì)胞組;
　?、揸幮愿蓴_

3、處理細(xì)胞+H/R組;
　?、逤IRP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞組;
　　⑧CIRP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞+H/R組;
　?、峥蛰d質(zhì)粒處理細(xì)胞組;
　?、饪蛰d質(zhì)粒處理細(xì)胞+H/R組.
　　(4)用western blot印跡法檢測(cè)CIRP和凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡狀況。
　　結(jié)果:
　　(1)心肌細(xì)胞缺氧處理時(shí),RT-PCR顯示CIRPmRNA表達(dá)兩小時(shí)有所下降,之后有明顯

4、增加,在14小時(shí)到達(dá)最高。western blot印跡法顯示CIRP蛋白表達(dá)隨著缺氧有明顯增加趨勢(shì),到14小時(shí)出現(xiàn)高峰。流式檢測(cè)表示隨著缺氧時(shí)間增加凋亡增加,6小時(shí)和8小時(shí)達(dá)高峰。
　　(2)在缺氧14小時(shí),0~8小時(shí)的復(fù)氧時(shí)間里,CIRP在缺氧14小時(shí)復(fù)氧2h這個(gè)時(shí)間表達(dá)最高。
　　(3)通過(guò)外源性轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒使 CIRP過(guò)表達(dá)并缺氧復(fù)氧組細(xì)胞caspase-3表達(dá)和凋亡率低于單純?nèi)毖鯊?fù)氧組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

5、;轉(zhuǎn)染CIRPsiRNA并缺氧復(fù)氧組細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量和凋亡率明顯高于單純?nèi)毖鯊?fù)氧組細(xì)胞,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。單純過(guò)表達(dá)CIRP組細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)低于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05,凋亡率低于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05;單純干擾細(xì)胞CIRP表達(dá)組caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率高于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。
　　結(jié)論:
　　(1)H9c2細(xì)胞中CIRP正常情況下存在低

6、水平表達(dá)。
　　(2)H9c2心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下,隨著缺氧時(shí)間增加冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白表達(dá)逐漸增加,在缺氧14小時(shí)及復(fù)氧2小時(shí)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,出現(xiàn)表達(dá)高峰。
　　(3)在缺氧14小時(shí)及復(fù)氧2小時(shí)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,高表達(dá)的CIRP能夠抑制H9c2心肌細(xì)胞的凋亡;
　　(4)在缺氧14小時(shí)及復(fù)氧2小時(shí)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,如果干擾CIRP表達(dá),則可以促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。
　　(5)過(guò)表達(dá)CIRP可使H9c2心