弓形蟲RNA結(jié)合蛋白Puf2的克隆表達(dá)、亞細(xì)胞定位及功能初探.pdf

1、背景:
　　剛地弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞原蟲，寄生于除紅細(xì)胞外的幾乎所有有核細(xì)胞內(nèi)，可侵犯腦、淋巴結(jié)、眼、肝、心、肺、肌肉等組織器官，從而引起人獸共患的寄生蟲病，如弓形蟲腦炎，弓形蟲眼病等。在宿主免疫功能正常的情況下，入侵的弓形蟲速殖子通常轉(zhuǎn)化為感染能力較弱的緩殖子，形成包囊，寄生在宿主的腦、肌肉和視網(wǎng)膜等細(xì)胞中，使宿主處于隱性感染狀態(tài);當(dāng)宿主患有艾滋病，惡性腫瘤等免疫功能受損或低下時(shí)，宿主體內(nèi)的包囊中的緩殖子能活化轉(zhuǎn)變

2、為速殖子，迅速增殖，引起組織破壞，形成局部炎癥，如不及時(shí)治療，可導(dǎo)致宿主的死亡。因此速緩殖子之間的相互轉(zhuǎn)換是剛地弓形蟲致病的中心環(huán)節(jié)。而弓形蟲急、慢性感染的生物學(xué)基礎(chǔ)及機(jī)制，不論是物理學(xué)或生物學(xué)上的原因，其本質(zhì)上都是在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯或者翻譯后的修飾水平上發(fā)生的改變，導(dǎo)致了不同蛋白的期特異性表達(dá)。在生物體內(nèi)正確的基因表達(dá)需要正確的時(shí)間，合適的數(shù)量以及在細(xì)胞內(nèi)正確的位置等各個方面的集體作用，而如此緊密的調(diào)控不僅需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)也需

3、要多層次的轉(zhuǎn)錄后控制。與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相比，基因表達(dá)的翻譯調(diào)控可以使細(xì)胞更迅速地對外部刺激作出響應(yīng)。如近年研究火熱的一類RNA結(jié)合蛋白-Puf蛋白，其中多項(xiàng)研究表明，從酵母到人類，Puf蛋白與靶RNA進(jìn)行特異性結(jié)合，誘導(dǎo)其發(fā)生降解或者是抑制其降解從而使生物體內(nèi)發(fā)生相應(yīng)的變化。Puf蛋白是以黑腹果蠅的Pumilio（Pum）蛋白及秀麗隱桿線蟲的Fem-3結(jié)合因子蛋白(FBF)進(jìn)行命名的RNA結(jié)合蛋白，通過結(jié)合靶mRNA3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3'UTR

4、)的特定核苷酸序列，通常稱為Puf-結(jié)合序列(Puf binding element，PBE)來行使翻譯調(diào)控。Puf蛋白的顯著特征是具有一個高度保守的核心RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，簡稱為Puf域(Puf domain)，通常由8個連續(xù)的相似的Puf-RNA結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域包含36～40個氨基酸，形成3個α-螺旋結(jié)構(gòu)，第一個和第八個結(jié)構(gòu)域兩端分別連接著一個不完全的結(jié)構(gòu)域。據(jù)多項(xiàng)研究表明，在布魯氏錐蟲這種原蟲中，Puf家族蛋白中的Puf1蛋白是影

5、響蟲體活力的一個必不可少的因素，其中Puf蛋白可以調(diào)控多種真核細(xì)胞的多種過程，如干細(xì)胞的維持，細(xì)胞器的生物合成，卵子的發(fā)生，神經(jīng)元功能和記憶的形成過程等。值得注意的是，Muller等在瘧原蟲Puf2基因的研究中，敲除惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲的Puf2基因后可促進(jìn)配子體分化并提高雄/雌配子體比例，而伯氏瘧原蟲的Puf2基因敲除后，存在于蚊子唾液腺內(nèi)的子孢子提早轉(zhuǎn)化成類似于肝內(nèi)早期階段的形態(tài)。上述研究揭示了Puf2蛋白在頂復(fù)門原蟲中起到調(diào)節(jié)m

6、RNA翻譯的一個分子作用機(jī)制。
　　同樣為頂復(fù)門原蟲的剛地弓形蟲中，是否存在Puf2蛋白及其在剛地弓形蟲速緩殖子轉(zhuǎn)化的過程中是否發(fā)揮了一定的作用？本文從分子生物學(xué)水平來對TgPuf2蛋白進(jìn)行特征分析，并探討其在弓形蟲速緩殖子中的表達(dá)情況，細(xì)胞定位，及對其的RNA結(jié)合能力進(jìn)行初探。
　　目的:
　　1、檢測在RH株剛地弓形蟲中是否存在Puf2;
　　2、觀察Puf2蛋白在RH株剛地弓形蟲速緩殖子的表達(dá)情況;

7、　　3、觀察Puf2蛋白在RH株剛地弓形蟲速殖子的亞細(xì)胞定位情況;
　　4、TgPuf2RNA結(jié)合功能初探。
　　方法:
　　1、為了檢測在RH株剛地弓形蟲中是否存在Puf2，根據(jù)Toxo DB數(shù)據(jù)庫中GT1株剛地弓形蟲Puf2蟲株基因序列(TGGT1_122890)設(shè)計(jì)特異性引物P1，以RH株cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
　　2、通過堿性培養(yǎng)基(pH8.2)誘導(dǎo)形成緩殖子，采用RT-qPCR方法檢測TgPuf2在速

8、殖子和緩殖子兩個時(shí)期的mRNA水平差異。
　　3、采用同源重組的方法在內(nèi)源性TgPuf2蛋白的C端融合表達(dá)3×HA標(biāo)簽，構(gòu)建TgPuf2-HA的轉(zhuǎn)基因弓形蟲蟲株。以RH蟲株的基因組DNA為模板擴(kuò)增Puf23'末端約1.5 kb的同源序列，特異性引物為P2擴(kuò)增產(chǎn)物插入pLIC-HAx3-DHFRTs內(nèi)源性標(biāo)記載體，使TgPuf2編碼序列與標(biāo)簽蛋白的編碼區(qū)可融合表達(dá)。
　　pLIC-Puf2HAx3-DHFRTs質(zhì)粒通過測序鑒定

9、正確無誤后轉(zhuǎn)染
　　RHΔKu80ΔHXGPRT蟲株，在HFF宿主細(xì)胞生長24小時(shí)后，用1.0μM乙胺嘧啶進(jìn)行藥物篩選。待抗藥蟲子長起來后傳代兩次，然后用有限制稀釋法篩選單克隆蟲株，最后通過Western Blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Immunofluorescence assay，IFA)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4、以RH株的cDNA為模版，用特異性引物P3擴(kuò)增TgPuf2的Puf2結(jié)構(gòu)域插入pET32a表達(dá)質(zhì)粒的BamHⅠ和Hind

10、Ⅲ多克隆位點(diǎn)之間。TgPuf2的Puf結(jié)構(gòu)域的C端融合表達(dá)組氨酸(His)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體蛋白用抗His的抗體進(jìn)行WesternBlot驗(yàn)證。通過親和純化獲得His融合表達(dá)的重組蛋白——rTgPuf2-His。
　　5、采用電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）實(shí)驗(yàn)檢測構(gòu)建的重組蛋白rTgPuf2-His中Puf結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合活性。
　　6、培養(yǎng)構(gòu)建

11、的C2號TgPuf2-HA轉(zhuǎn)基因蟲株，收集蟲體后進(jìn)行免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)實(shí)驗(yàn)，獲得沉淀后進(jìn)行總RNA的提取后送質(zhì)譜分析，檢測與Puf2相結(jié)合的RNA種類。
　　結(jié)果:
　　1、采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)，證明在RH株剛地弓形蟲中有Puf2基因。
　　2、比較TgPuf2在速殖子期和緩殖子期mRNA水平，RT-qPCR結(jié)果顯示TgPuf2在mRNA水平緩殖子期低于速殖子期。
　　3、

12、通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)和Western blot鑒定，成功構(gòu)建了TgPuf2-HA的轉(zhuǎn)基因弓形蟲蟲株。挑選兩個單克隆蟲株C1、C2作為后續(xù)蛋白表達(dá)的分析。用抗HA抗體通過Western blot檢測顯示一條大約206kDa大小的條帶，與預(yù)測TgPuf2融合HA×3標(biāo)簽表達(dá)蛋白分子量大小相符，其母本蟲株RHΔKu80未見反應(yīng)條帶。
　　4、用抗HA抗體通過IFA實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)TgPuf2主要定位于蟲體胞漿中。
　　5、重組