家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BmMFS的研究.pdf

1、膜蛋白在生物體的生命活動(dòng)中不可或缺，主要承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)和能量的交換。大多數(shù)的藥物以膜蛋白為靶點(diǎn)，因此解析膜蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)于藥物設(shè)計(jì)起著非常重要的作用。然而膜蛋白由于天然含量低，分離提純困難以及克隆表達(dá)的缺陷等因素導(dǎo)致研究進(jìn)展緩慢。主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（majorfacilitatorsuperfamily，MFS）是一個(gè)主要的次級(jí)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。由于轉(zhuǎn)運(yùn)底物的多樣性，使得它們?cè)诩?xì)胞能量代謝和物質(zhì)交換過(guò)程中起重要作用。MFS超家族

2、在低等生物和高等生物中廣泛存在，成員眾多。由于膜蛋白的結(jié)構(gòu)解析存在很多困難，到目前為止，只有5種MFS蛋白結(jié)構(gòu)被解析清楚，且全部來(lái)源于細(xì)菌。家蠶中未見(jiàn)該蛋白的相關(guān)報(bào)道。多角體蛋白(Polyhedrin，Polh)是昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)后晚期高效表達(dá)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，分子量約為29kD，其形成的包涵體可在pH10.8以上的緩沖液中溶解。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，多角體蛋白自N端起的20個(gè)氨基酸殘基的片段(Ph20)保留了多角體晶體的部分特性，在pH

3、值回調(diào)至8.0時(shí)融合蛋白依然存在于上清中。利用這種特性，可將外源基因與Ph20基因融合表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)pH簡(jiǎn)單純化目的蛋白。
　　在本實(shí)驗(yàn)室家蠶蛹cDNA文庫(kù)中篩選到一條ORF為915bp的序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白含有304個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)含有六個(gè)跨膜區(qū)的蛋白，包含一個(gè)MFS保守結(jié)構(gòu)域，將其命名為BmMFS。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Ph20-BmMFS，在Ph20和BmMFS基因中間引入凝血酶(Thromb

4、in)酶切位點(diǎn)的核酸序列。轉(zhuǎn)化E.coliRosetta，1mMIPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。利用Ph20的溶解特性通過(guò)調(diào)節(jié)pH進(jìn)行初步純化，鎳柱親和層析進(jìn)一步純化，經(jīng)Westernblotting和質(zhì)譜鑒定該融合蛋白為Ph20-BmMFS。利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒vPh20-BmMFS，感染家蠶BmN細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)病后經(jīng)Westernblotting檢測(cè)，結(jié)果顯示融合蛋白成功表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，BmMFS基因在家蠶五齡